Для начала подготовьте четыре листа фильтровальной бумаги, каждый размером 12,5 на 7,5 сантиметров. Сложите два листа вместе и поместите стопку в буфер для переноса, чтобы она пропиталась. Поместите мембрану из ПВДФ в 95% этанол и помешивайте мембрану на коромысле в течение одной минуты.
Вспомните этанол. Погрузите мембрану в буфер для переноса. И помешивать в течение двух минут.
Затем положите стопку фильтровальной бумаги для замачивания на плоскую подвижную поверхность, например, на большую крышку, и разровняйте ее с помощью валика. С помощью гелевого релизера или пинцета аккуратно расположите мембрану из ПВДФ на стеке. После этого положите один лист сухой фильтровальной бумаги на эту мембрану и проведите роликом по бумаге, чтобы впитать излишки буфера, которые находятся на поверхности мембраны.
Снимите верхнюю фильтровальную бумагу, не трясь о мембрану. Возьмите изолированные образцы волокна из морозильной камеры и разморозьте их при комнатной температуре перед центрифугированием и тщательным повторным взвешиванием образца. Поместите по одному микролитру капли каждого образца в центр обозначенной области мембраны.
Не прикасайтесь к мембране наконечником пипетки. Дайте каплям образца полностью впитаться в мембрану в течение 15 минут. Затем с помощью гелевого релизера или пинцета осторожно приподнимите мембрану из влажной стопки фильтровальной бумаги.
Положите его на сухой лист фильтровальной бумаги и оставьте не менее чем на пять минут для обезвоживания. Реактивируйте мембрану после того, как пятна образца станут полностью белыми. Затем приступают к иммуномечению целевого белка.
Узнайте, как использовать интенсивность сигнальной панели для классификации интенсивности изоформ MHC и сигналов Actin по изображениям точечных блоттингов. Сильное, среднее и малое обнаружение белка-мишени проявляется в виде насыщенных, умеренных и слабых сигналов соответственно. Для определения типа волокна сначала сравните результаты тяжелой миозиновой цепи IIA и первой миозиновой тяжелой цепи.
Задокументируйте волокна, которые демонстрируют только одну изоформу тяжелой миозиновой цепи с насыщенной или умеренной интенсивностью сигнала. Запишите волокна, обнаруженные с помощью актина, и отсутствие обнаружения миозина тяжелой цепи 1 или IIA как потенциального типа 2X. Если слабый сигнал изоформы тяжелой цепи миозина присутствует с умеренным денасыщенным сигналом актина, запишите его как неидентифицированный.
Отбраковывайте образцы со слабыми или необнаруженными белками-мишенями. Волокна, демонстрирующие насыщенные или умеренные сигналы как MHCIIA, так и MHC1, не следует использовать для получения клетчатки, специфичной для конкретного типа. После MYO1D ID подготовьте образцы первого и второго типов, комбинируя волокна с насыщенными или умеренными сигналами для соответствующей изоформы MHC.
Используйте 10 микролитров каждого образца для конкретного типа волокна и разделите их на сборном геле по странице SDS, следуя рекомендациям производителя. Используйте гелевый тепловизор для определения целевого изоформа MHC, следуя протоколу производителя. Сравните интенсивность сигнала каждой изоформы MHC во всех образцах для конкретного типа волокна.
Идентификатор типа волокна подтверждается правильным изоформом MHC при умеренной или насыщенной интенсивности сигнала. Иммуномаркировка дот-блоттинга позволила идентифицировать волокна второго типа, волокна первого типа и потенциальные волокна типа 2X. Были валидированы образцы, специфичные для типа волокна, с использованием вестерн-блоттинга и специфических антител к тяжелой цепи миозина.
