Начните с запуска программного обеспечения для анализа изображений. Затем откройте файл Z-стека и отрегулируйте ориентацию, чтобы разместить волокно горизонтально. Выберите прямоугольную область интереса или ROI, охватывающую митохондриальную область.
Выбирайте размеры в диапазоне от 65 до 90 микрометров в направлении X и соответствующие размеры в направлении Y в зависимости от ширины волокна. Перейдите к дублированию Z-стека с выбранным ROI. И сохраните его как новый Z-стек в формате Tiff.
Сохраните позицию ROI из исходного стека с помощью инструмента ROI Manager. Откройте диалоговое окно порога с помощью сочетания клавиш Command+Shift+T. Выберите алгоритм порога Оцу и выберите вариант черно-белого темного фона.
Обратите внимание на гистограмму распределения интенсивности флуоресценции и пороговое значение, отображаемое в диалоговом окне. Примените пороговое значение к стеку двоичных изображений, затем выберите «Вычислить пороговое значение» для каждого изображения и создайте новый стек в открывшемся диалоговом окне, прежде чем нажать кнопку «ОК». Сохраните стопку, созданную из трех двоичных изображений в формате Tiff. Затем откройте меню «Анализ» и выберите «Гистограмма».
В открывшемся диалоговом окне Гистограмма нажмите кнопку Да. И в диалоговом окне Гистограмма стека нажмите на Список, чтобы получить данные гистограммы. Переносите данные гистограммы в таблицу и идентифицируйте митопиксели со значением 255.
Рассчитайте плотность митохондрий, разделив митопиксели на общее количество пикселей и умножив на 100. Волокна крысы с ожирением имели более низкую плотность митохондрий. Это было подтверждено анализом изображений стека.
