Начните с пипетирования 0,5 миллилитров культуры логарифмической фазы хлореллы обыкновенной. Разложите культуру на тарелке с трис-ацетат-фосфатом или TAP Agar. Выращивайте культуру в течение пяти дней при температуре 25 градусов тепла.
Затем закиньте 10 миллилитров добавленного бульона LB в петлю, полную культуры электропорированной агробактерии tumefaciens в колбе-шейкере. Инкубируйте колбу при температуре от 28 до 30 градусов Цельсия и 250 об/мин в течение ночи. На следующий день внесите один миллилитр ночной культуры в 50 миллилитров добавки LB. Инкубируйте колбу при температуре от 28 до 30 градусов Цельсия и 250 об/мин.
Совместное культивирование водорослевых и бактериальных культур. Сначала переложите культуру агробактерии в 50 миллилитровую пробирку. Центрифугируйте пробирку при 4 000 G в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем издайте надосадочную жидкость пипеткой, чтобы сбросить ее, и дважды промойте клетки с помощью индукционной среды. Затем добавьте 25 миллилитров индукционной среды в планшет для культивирования Chlorella Vulgaris. Переложите клетки в 50-миллилитровую пробирку, затем центрифугируйте при 4000 G в течение 15 минут при комнатной температуре.
После утилизации надосадочной жидкости соедините гранулу клеток водорослей с 200 микролитрами бактериальной суспензии. Встряхните объединенную культуру в ротационном инкубаторе при температуре от 21 до 25 градусов Цельсия, то есть при 150 об/мин в течение одного часа. Распределите 200 микролитров смешанной культуры на планшеты для индукционной среды, добавив 15 миллимоль глюкозы, и инкубируйте планшеты в темноте при температуре от 21 до 25 градусов Цельсия в течение трех дней.
Через три дня соберите микроводоросли в колбу, используя 10 миллилитров среды TAP. Дополнен 20 миллиграмм на литр тетрациклина. Выдерживайте колбу в темноте в течение двух дней, поддерживая температуру от 21 до 25 градусов по Цельсию.
Насыпьте 500 микролитров культуры на селективную среду с добавлением 20 миллиграмм на литр тетрациклина. Инкубируйте планшеты при температуре от 21 до 25 градусов Цельсия в темноте в течение двух дней, прежде чем переместить их в камеру с подсветкой. Выберите одиночные колонии с трансформационной пластины и нанесите их на агаровые пластины TAP.
Чтобы провести колонийную ПЦР, начните с добавления небольшого объема трансформирующих клеток водорослей в 10 микролитров стерильной воды. Кипятите раствор при температуре 98 градусов Цельсия в течение 15 минут. Аналогично обработайте еще одну ПЦР-матрицу для подтверждения отсутствия агробактерий в образце.
Прогоните образцы ПЦР на ДНК-агарозном геле с помощью лестницы, чтобы проверить размер полученных фрагментов. Трансформированные колонии были способны расти на пластинах, содержащих гигромицин с цефотаксимом. Колонии дикого типа на пластинах не росли.
Получены колонии, устойчивые к концентрации до 70 миллиграммов на литр цефотаксима. Colony PCR Amplicon of pCAMBIA1302 отсутствовал в образцах водорослей. Тем не менее, MGFP5G в ампликоне был обнаружен во всех трех образцах водорослей.
В культурах водорослей, которые неоднократно являлись субкультурами цефотаксима, было выявлено отсутствие белка вирулентности Е2, что свидетельствует об отсутствии плазмиды. Наблюдалась значительная разница в росте водорослей трансформантов и штаммов дикого типа. Несмотря на более низкий рост, трансформант имел более высокие уровни флуоресценции при нормализации по плотности клеток.
