Для начала инкубируйте оплодотворенные куриные яйца во влажном инкубаторе при температуре 38 градусов Цельсия. Теперь препарируйте спинную кожу куриного эмбриона на стадии от 30 до 33 в HBSS. Затем инкубируйте кожуру в двукратном растворе без кальция и магния с 0,25% ЭДТА в течение 15-20 минут.
Аккуратно отделите эпителий и мезенхиму с помощью часовых щипцов и переместите отделенный материал в HBSS, помещенный на лед. Соберите отделенную мезенхиму в 15-миллилитровую центрифужную пробирку и добавьте два миллилитра 0,1% коллагеназы трипсина, произведенного в PBS. Затем инкубируйте раствор на водяной бане.
Далее с помощью пастеровской пипетки диспергируйте мезенхиму кожи в одноклеточную суспензию. Затем добавьте восемь миллилитров DMEM, содержащего 10% фетальной бычьей сыворотки, чтобы остановить пищеварение. Центрифугируйте ячейки при температуре 233G в течение пяти минут.
Затем повторно суспендируйте гранулу в питательной среде. Затем поместите вкладыш для клеточной культуры в лунку шестилуночной чашки, капните на вкладыш каплю мезенхимальных клеток объемом 10 микролитров. В лунку с внешней стороны вкладыша нанесите пипеткой два миллилитра DMEM с 10%-ной фетальной бычьей сывороткой.
Инкубируйте гальванизированные клетки при температуре 37 градусов в инкубаторе с 5% углекислым газом и 95% воздухом в течение одного часа. С помощью пипетки объемом в один миллилитр перенесите неповрежденный эпителий поверх покрытой мезенхимальной капли. Расплющите неповрежденный эпителий над мезенхимой, чтобы образовался восстановленный кожный эксплант.
Оставьте тонкий слой медиума на вставке, чтобы кожица экспланта оставалась полувлажной. Обеспечивая интерфейс воздух/жидкость, инкубируйте восстановленный кожный эксплант при температуре 37 градусов в инкубаторе с 5% углекислого газа и 95% воздуха. Органные культуры ex vivo сначала кажутся однородными: короткие перьевые почки образуются после двух-трех дней в культуре, а длинные перьевые почки образуются через четыре-пять дней в культуре.
