Одноклеточная диссоциация мышиных островков для проточного цитометрического анализа β-клеточной митофагии

Начните с культивирования образцов люверсов, выделенных от обычных жировых мышей или мышей с высоким содержанием жиров, в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Разработайте желаемые экспериментальные условия для исследования. Для каждого экспериментального условия с помощью пипетки наберите 100 глазков в шестисантиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитра среды для глазков.

Чтобы вызвать митофагию, обработайте люверсы в соответствующих чашках Петри двумя микролитрами 250 наномолярного запаса валиномицина в течение трех часов. Изолируйте люверсы и с помощью пипетки перенесите люверсы из каждой чашки Петри в отдельную микроцентрифужную пробирку. Затем вращайте люверсы при температуре 350 G в течение одной минуты при температуре 10 градусов Цельсия и с помощью пипетки выбросьте надосадочную жидкость.

Полученный образец дважды промойте одним миллилитром PBS. Между промывками открутите образец и выбросьте надосадочную жидкость, как было показано ранее. Чтобы диссоциировать люверсы на отдельные клетки, добавьте 500 микролитров 0,05%-ного трипсина, предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия, в одну пробирку с образцом.

Пипетка многократно выводит содержимое пробирки вверх и вниз до тех пор, пока проушины не станут заметно рассеянными. Сразу же добавьте один миллилитр подогретой среды для нейтрализации трипсина. Вращайте образцы при температуре 500 G в течение пяти минут при температуре 10 градусов Цельсия.

Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Затем промойте образцы два раза проточной средой с проушинами. В настоящее время образцы клеток готовы к окрашиванию для проточного цитометрического анализа митофагии бета-клеток.