Создание 3D-гематоэнцефалического барьера, полученного из стволовых клеток человека in vitro

Соберите гематоэнцефалический барьер, полученный из плюрипотентных стволовых клеток человека, используя диссоциированные эндотелиальные клетки, паразитов и астроциты, объедините три типа клеток в конической трубке, включив при этом на 10% больше рассчитанного количества клеток для учета ошибок пипетирования. Убавьте клеточную смесь до 300 г в течение трех минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя клеточную гранулу примерно с 50 микролитрами среды.

С помощью пипетки P200 аккуратно суспендируйте клеточную гранулу в остаточной среде, чтобы создать одноклеточную суспензию. Поместите пробирку, содержащую полученную клеточную суспензию, на лед и добавьте в нее достаточное количество восстановленной матрицы базальной мембраны GF в расчете на желаемое количество iBBB. Перемешайте клетки равномерно, не вводя пузырьков воздуха.

Пипеткой нанесите 50 микролитров полученной смеси клеточного матрикса в лунку 48-луночной или 96-луночной чашки для культуры со стеклянным дном и равномерно распределите ее по всему дну чашки. Инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-40 минут, чтобы полимеризовать матрикс и инкапсулировать клетки. Наконец, добавьте 500 микролитров добавки астроцитарной среды в лунку и поддерживайте iBBB в культуре.

Для планшета на 96 лунок добавьте от 100 до 150 микролитров среды в лунку, пока она не станет достаточно развитой для последующих анализов, что обычно занимает две недели. Правильно сформированный iBBB выглядел как затвердевший одиночный полупрозрачный диск под светлопольным микроскопом. Через 24 часа были идентифицированы равномерно распределенные одиночные клетки.

Через две недели стали видны более отчетливые структуры, хотя и трудно поддающиеся определению, но они.