Для начала введите в мозг мыши векторы, связанные с AAV. После трех-четырех недель инъекции вируса побрейте брюшную и заднюю области шеи мыши, находящейся под наркозом. Очистите выбритые участки с помощью трех йодных скрабов по очереди с 70% раствором этанола.
Сделайте вентральный разрез на коже между лопатками. После этого наложите хирургическую марлю на разрез и расположите животное в лежачем положении, головой к хирургу. Затем сделайте небольшой вертикальный разрез с правой стороны шеи, над ключицей, чтобы обнажить правую сонную артерию и яремную вену.
После отделения подкожной клетчатки обнажите правую наружную яремную вену и наложите шов под вену. Перевяжите дистальный конец яремной вены, чтобы остановить кровоток. С помощью микрощипцов и ножниц сделайте небольшой разрез в отколотой вене.
Теперь вставьте венозный катетер скосом, направленным вниз, и переместите его проксимально по направлению к верхней полой вене, пока он не достигнет правого предсердия. С помощью шелкового шва 7-0 закрепите катетер на сосуде. Рассеките соединительные ткани, чтобы обнажить правую общую сонную артерию.
Проксимально предварительно установите две шовные петли из шелковых швов 7-0, которые остаются незакрепленными на уровне разделения внутренней и наружной сонных артерий. Чтобы временно остановить кровоток, потяните за заранее установленную шовную петлю. Затем с помощью микроножниц или иглы 27 калибра создайте небольшое отверстие на стенке сосуда.
Введите артериальный катетер проксимально, освобождая шовную петлю, и продвигайте катетер, чтобы достичь дуги аорты, не касаясь аортального клапана. С помощью двух предварительно наложенных швов закрепите катетер на сосуде. Подкожно проведите туннель всех катетеров, выведите их наружу в задней части шеи через предварительно разрезанный разрез и закройте вентральный разрез.
Присоедините катетеры к венозным или артериальным портам соединителя трубки с силиконовым покрытием, изготовленного из игольчатой трубки 25-го калибра. После закрытия вентрального разреза закрепите соединитель подкожно, когда кожа задней части запечатана швами. С помощью хирургических проводов из нержавеющей стали заполните катетеры гепаринизированным физиологическим раствором и плотно закупорьте концы катетеров.
Чтобы подключить животное к автоматизированной системе забора крови через 24 часа после операции, подсоедините крючок для троса к металлическому кольцу на задней части шеи и подключите артериальный катетер. После того, как артериальный катетер будет подключен к инъекционной линии, присоедините венозные катетеры к капельницам для забора проб. Установите время введения и дозу в размере 0,5 миллиграмм на килограмм в 500 микролитров в минуту.
Установите время и частоту забора крови, включая разведение образца физиологическим раствором. Система автоматически восполнит равное количество физиологического раствора для замены взятой крови. Выполните автоматический предварительный впрыск.
Далее выполняют автоматизированное внутривенное введение препарата клозапина N-оксида со скоростью инъекции 500 микролитров в минуту. Затем проведите забор крови после инъекции. Представлены паттерны лютеинизирующего гормона у взрослых самок Kiss1-EYFP, получавших одностороннюю стереотаксическую инъекцию AAV-hM3Dq-mCherry в дугообразное ядро.
Уровень лютеинизирующего гормона диэструса, как правило, низкий, но обычно наблюдаются колебания из-за его пульсирующего высвобождения. Резкое повышение уровня лютеинизирующего гормона происходит в ответ на инъекцию N-оксида клозапина. Большинство нейронов mCherry, локализованных совместно с Kiss1-EYFP, продемонстрировали, что вирусная и нейрональная активация специфична для целевой популяции.
Показана пульсирующая структура высвобождения лютеинизирующего гормона у мышей дикого типа diestrus с последующей реакцией на инъекцию кисспептина-10 в виде IP. Наблюдались четкие импульсы лютеинизирующего гормона, типичные для женщин в диэструсе, показывающие низкий уровень базального лютеинизирующего гормона. Немедленное и устойчивое повышение лютеинизирующего гормона было обнаружено в ответ на введение кисспептина.
