Для начала добавьте 30 граммов хлорида натрия в шесть литров деионизированной воды в оболочку для жидкости и встряхните бак, чтобы соль растворилась. Затем подключите бак к сортировщику ячеек. Включите сортировщик ячеек, запустите жидкостную систему и подождите, пока жидкость уравновесится.
Настройте задержку сброса. Чтобы приготовить исходный раствор дрожжевого экстракта, ресуспендируйте одну аликвоту дрожжевого экстракта углерода 13 в 7,5 миллилитрах сверхчистой воды и 2,5 миллилитрах метанола. Затем, чтобы приготовить буфер для экстракции, добавьте 10 микролитров исходного раствора экстракта углерода 13 дрожжей к 10 миллилитрам ацетонитрила и хорошо перемешайте.
Добавьте 25 микролитров экстракционного буфера в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета и накройте лунки крышкой. Поместите пластину на сортировщик клеток, чтобы собрать отсортированные ячейки. Отсортируйте по 5000 событий из каждой из положительных и отрицательных популяций Alexa Fluor 647 в первые четыре лунки.
Затем отсортируйте по 5000 событий из каждой из PE-положительных и Alexa Fluor 647 отрицательных популяций в следующие четыре лунки. Затем для гемопоэтических стволовых клеток отсортируйте 5000 событий из низкой популяции PE-Cy7, PE положительной, APC-Cy7 положительной, Brilliant Violet 605 положительной и Brilliant Violet 421 отрицательной популяции в первую лунку, а затем отсортируйте 5000 событий PE-Cy7 низкой, PE положительной, APC-Cy7 положительной, Brilliant Violet 421 положительной и Brilliant Violet 605 отрицательной популяции в следующую лунку. Для образцов обломков выбирайте события, слишком маленькие, чтобы представлять неповрежденные ячейки на основе сигналов прямого и бокового рассеяния.
Далее включите прибор ЖХ-МС. Поместите пластину для образцов в автоматический сэмплер прибора. Откройте программное обеспечение, совместимое с LC-MS, и подготовьте прибор к анализу.
Запустите по крайней мере четыре заготовки или пул образцов для уравновешивания колонки и тестовой смеси LC для проверки хроматографических характеристик. Убедитесь, что начальное и максимальное противодавление меньше 150 и 400 бар соответственно. Затем убедитесь, что время хранения укладывается в одну минуту.
Затем убедитесь, что впадина между лейцином и изолейцином в положительном переходе от 132 до 86 составляет менее 20% высоты пика. Наконец, убедитесь, что разница во времени удержания между AMP и ADP составляет от 1,5 до 1,9 минут, а между ADP и ATP — от 1,1 до 1,5 минут. После подтверждения экспериментальных параметров настройте прогон с технологической заготовкой или образцом пула, чтобы свести к минимуму перенос из тестовой смеси LC, а затем с тестовыми образцами в случайном порядке.
Сортировка FACS позволяет выделять чистые популяции различных типов клеток из одной и той же клеточной суспензии. Метаболические различия между типами клеток из одной и той же ткани сохраняли с помощью протокола FACS cell CMS для гемопоэтических стволовых клеток и мультипотентных клеток-предшественников. Клетки шести мышей потребовались для создания шести образцов, что привело к большей вариабельности внутри каждой группы по сравнению с В- и Т-клетками, которые были отсортированы из одной и той же селезенки мышей.
Образцы мусора, представляющие собой контрольные образцы с заготовками, были четко отделены от образцов, содержащих клеточные экстракты. Здесь показана тепловая карта, показывающая информацию об относительных уровнях метаболитов в различных типах клеток.
