Для начала наполните стакан Dounce двумя миллилитрами ледяного буфера для лизиса ядер, содержащего 0,01% дигтонина, и добавьте в него рассеченные кусочки ткани мозга мыши. С помощью стеклянного гомогенизатора тканей Dounce гомогенизируйте ткань 25 раз с помощью пестиков А и В и переложите полученный гомогенат в 15-миллилитровую пробирку. Добавьте в гомогенат два миллилитра ледяного буфера для лизиса ядер, содержащего 0,01% дигтонина, и инкубируйте на льду в течение пяти минут.
Затем центрифугируйте ядра при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. С помощью микропипетки удалите надосадочную жидкость и добавьте четыре миллилитра ледяного буфера для лизиса ядер, содержащего 0,01% дигитонина. Отфильтруйте ядра суспензии через клеточный фильтр с плотностью 40 микрометров.
Снова центрифугируйте ядра, удалите надосадочную жидкость и добавьте четыре миллилитра красящего буфера для промывания ядер. После фильтрации суспензии через клеточное сетчатое фильтр с температурой 40 микрон, гранулируйте ядра центрифугированием и ресуспендируйте ядра в одном миллилитре PBS, содержащем 0,04% БСА и ингибиторы РНКазы. Чтобы подсчитать клетки, смешайте 10 микролитров 0,4%-ного трипанового синего с 10 микролитрами ядер в 0,5-миллилитровой пробирке.
Подсчитайте ядра с помощью автоматического счетчика клеток. Перенесите 100 микролитров ядер в пробирку FACS для неокрашенного контроля. Добавьте 10 микролитров 7-AAD к оставшимся ядрам и инкубируйте в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, а затем приступайте к сортировке ядер с помощью FACS.
Затем перенесите 10 микролитров отсортированных ядер в новую пробирку FACS, содержащую 90 микролитров DPBS с 2% термоинактивированным FBS. После центрифугирования отсортированных ядер удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки и ресуспендируйте ядра в 100 микролитрах буфера для разбавленных ядер. Перед сортировкой образец содержит значительные остатки с более чем 99% синглетов, положительных на ядерное окрашивание, что указывает на эффективный лизис клеток.
Ядра мозга после сортировки продемонстрировали увеличение чистоты с исходных 36% до почти 100%
