Для начала пометьте две новые факсимильные трубки как смешанные трубки первая и вторая. Приготовьте суспензию клеток и антител в соответствии с приведенной таблицей для проведения проточного цитометрического анализа. После инкубации пробирок в течение 30 минут промойте каждую пробирку два раза одним миллилитром буфера для окрашивания.
Центрифугируйте вортексированные пробирки при 200 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах красящего буфера. Смажьте лунки 48-луночной пластины от 200 до 500 микролитров FBS и выдержите в течение одного часа.
Затем пипетку от 200 до 500 микролитров 10% MSC среды после удаления остатков FBS. Чтобы подготовить образцы к сортировке по одной ячейке, пипеткой направьте один миллилитр FBS в две новые факсимильные трубки. Сверните трубки, чтобы создать равномерный слой FBS на внутренней поверхности трубки.
Приготовьте суспензию клеток и антител в первой и второй пробирках, согласно таблице, для эксперимента по сортировке. Затем инкубируйте трубки в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. После промывки с буфером для окрашивания пробирки центрифугируют при 200 G в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах красящего буфера и инкубируйте в течение 15 минут в пяти микролитрах DAPI перед сортировкой. Для настройки компенсационной матрицы используйте одинарные компенсационные трубки. Нажмите на кнопку «Эксперимент» на панели инструментов в программном обеспечении прибора.
Затем нажмите «Настройка компенсации», а затем создайте элементы управления компенсацией. Далее нажмите на неокрашенную пробирку, за которой последуют параметры в диалоговом окне цитометра. Отрегулируйте напряжения, отредактировав значения для каждого параметра.
Нажмите «Загрузить» на панели «Приобретение», а затем нажмите «Получить». Перетащите вентиль P-1 в популяцию клеток и примените его ко всем элементам управления компенсацией, чтобы установить напряжение и отрицательный вентиль для каждого параметра. Теперь загрузите одиночные пробирки для компенсации пятен по отдельности.
Запишите данные и сохраните их. Выберите текущий эксперимент, щелкните по нему правой кнопкой мыши и выберите «Рассчитать значения компенсации», перейдите по ссылке и сохраните. Запустите смешанную трубку один и запишите 10 000 ячеек.
Установите ворота на интересующую популяцию, которую необходимо отсортировать, с помощью правильной стратегии стробирования. Затем загрузите в прибор сборную пластину и установите целевое количество ячеек, варьирующееся от 2 500 до 5 000 ячеек на лунку. Затем выберите маску чистоты сортировки по одной ячейке.
Соберите отсортированные популяции клеток в устройство для сбора, удерживая их на льду в течение всего эксперимента по сортировке. Наконец, переместите планшеты в инкубатор с 5% углекислым газом, чтобы поддерживать температуру культур при температуре 37 градусов по Цельсию. Многопараметрические графики проточной цитометрии не показали экспрессии изотипа FITC антител CD 90 FITC.
Положительная экспрессия маркеров CD-90 и CD-73 и отрицательная экспрессия CD-45 сопоставимы с таковой у их неокрашенных и FMO контрольных групп. Иммунофенотипы показали распределение маркеров из одного из ранних пассажей с рекомендованными ISCT маркерами и CD-44, определяя родительские популяции как МСК. Поздние проходные ангары использовались для сортировки по одной ячейке высоких и тусклых экспрессоров.
Отсортированные после сортировки клетки, собранные в 48-луночной пластине, показали адгезию и пролиферацию, как и их родительская популяция. Постсортированные клетки дифференцировались в присутствии адипогенных факторов роста.
