После автоклавирования двух силиконовых пластин в стерильных условиях извлеките пластины из автоклавного пакета и поместите их в 150-миллиметровые пластины. Добавьте 400 микролитров раствора фибронектина в каждую лунку силиконовых пластин. Затем повторно суспендируют индуцированные склераксом мезенхимальные стромальные клетки в среде МСК и подсчитывают жизнеспособные клетки с помощью автоматического счетчика клеток.
Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для получения 1,25 умножить на 10 четвертых клеток на квадратный сантиметр. Извлеките этот объем МСК из 15-миллилитровой конической пробирки и добавьте необходимый объем склеракс-положительной индуцированной суспензии мезенхимальных стромальных клеток. Переверните трубку для однородности новой клеточной суспензии.
Добавьте 400 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку обеих силиконовых пластин. Накройте крышкой 150-миллиметровые пластины и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Для одноосного натяжения промойте растягивающее устройство двойной дистиллированной водой с последующим добавлением 70%-ного этилового спирта.
Протрите аппарат, поместите его в колпак для клеточных культур и подвергните воздействию ультрафиолета в течение 15 минут. Далее поместите одну пластину в инкубатор в качестве статического контроля. Поместите вторую сидячую силиконовую пластину в растягивающее устройство, совместив винты с отверстиями в силиконовой пластине.
Затем накройте аппарат крышкой. Прикрепите аппарат с сидящей силиконовой пластиной к электронному источнику и поместите его в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию. Установите программу циклического растяжения на 4% синусоидальную деформацию в 0,5 герц в течение двух часов в день.
Начните растяжку, нажав кнопку старта. При механической нагрузке склераксис индуцированными мезенхимальными стромальными клетками чрезмерно высокая плотность посева приводила к преждевременному сокращению клеток и ранней их гибели. После нескольких дней растяжения наблюдалась некоторая степень организации клеток в группе с индуцированными мезенхимальными стромальными клетками, индуцированными склераксисом, по сравнению со случайной организацией клеток в статической группе.
Фаллоидиновое окрашивание актонных филаментов показало, что клетки росли перпендикулярно направлению растяжения, в отличие от случайной организации клеток, наблюдаемой в статических пластинах. Анализ экспрессии генов показал значительное повышение регуляции теногенных генов как через три, так и через семь дней, по сравнению только с IMSC на нулевой день. Отложение коллагена в средах после семи дней растяжения было значительно выше в группе с индуцированными мезенхимальными стромальными клетками, индуцированными склераксисом, по сравнению со всеми остальными группами.
