Визуализация кальция мозга дрозофилы ex vivo для анализа эпилептиформ

Для начала процедите наружный раствор с кислородным раствором в течение пяти минут. С помощью пипетки перенесите 10 микролитров раствора для рассечения в чашку Петри. Теперь с помощью шприцевых игл и микроскопа тщательно препарируйте мозг обезболившихся диких и нокаутированных мух.

С помощью пипетки перенесите подготовленный мозг в записывающую чашку с пятью миллилитрами наружного раствора. Обездвижите мозги с помощью держателя для С-острых предметов. Затем сделайте конфокальный снимок каждого мозга с кратностью 20x.

Используйте режим сканирования XYT и идентифицируйте нейроны грибовидного тела при дополнительном в 4,5 раза цифровом усилении. Установите лазерное возбуждение на 488 нанометров с мощностью лазера 16 микроватт, чтобы получить излучение всего мозга GCaMP6m. Затем установите параметры сканирования на скорость 1400 с размером пикселя 256 на 256 пикселей.

Установите скорость захвата на 5,3 герц и записывайте в течение трех минут. Проанализируйте флуоресценцию от пяти до восьми областей интереса. Вручную определите клеточное тело нейронов тела гриба в качестве области интереса.

Используйте изображение J для маркировки идентифицированных нейронов и измерения интенсивности их флуоресценции. Проанализируйте данные флуоресценции GCaMP6m, как показано на рисунке. Определите внутриклеточную флуоресценцию, увеличивающуюся от двух до 2,5 стандартных отклонений, как малые спайки, а увеличивающиеся более чем на 2,5 стандартных отклонения как большие спайки.

В грибовидном теле мух наблюдались кальциевые сигналы. У мух-нокдаунов cac было больше больших шипов, чем маленьких.