Эксперимент по воздействию света для активации BMP или узловой сигнализации у рыбок данио

Для начала инкубируйте введенные эмбрионы данио-рерио при температуре 28 градусов Цельсия. Около 1,5 HPF на стадии от 4 до 16 клеток удаляют неоплодотворенные и нездоровые эмбрионы. Для анализа фенотипирования оберните неэкспонированную контрольную пластину с неинъецированными и инъецированными эмбрионами в алюминиевую фольгу.

Поместите пластину, покрытую фольгой, на нижнюю полку, а открытую — на верхнюю полку светового короба с температурой 28 градусов Цельсия. Убедившись, что крышка посуды на месте, включите синий свет и закройте дверцу светового короба, чтобы предотвратить непреднамеренное воздействие света в комнате. Для иммунофлуоресцентного анализа около 1,5 HPF по отдельности оберните подвергшуюся воздействию и неэкспонированную чашку в алюминиевую фольгу, держа чашку нераскрытой.

Поставьте всю посуду в световой короб с температурой 28 градусов Цельсия, не активируя светодиод. Закройте дверцу светового короба, чтобы предотвратить случайное попадание света в помещение. При примерно пяти HPF используйте препарирующий эндоскоп для оценки стадии развития прокси-эмбрионов.

Также снимите завернутую посуду, чтобы обеспечить равномерное воздействие температуры на всю посуду. Как только зародыши дойдут до 40% эпиболи, откройте открытую чашку и поставьте ее на верхнюю полку светового короба. Держите неоткрытую тарелку накрытой на нижней полке.

Немедленно включите синий свет, закройте дверцу и установите таймер на 20 минут. Чтобы подготовиться к фиксации, исключите как можно больше света в помещении. Непосредственно перед фиксацией возьмите трубки, содержащие 4% формальдегида от четырех градусов Цельсия, и расположите их рядом со световым коробом.

Через 20 минут откройте дверцу светового короба и уберите посуду, на которую не попадал свет. Используйте наконечник пипетки из обожженного стекла, чтобы удалить светочувствительные эмбрионы из чашки. Затем, чтобы погрузить эмбрионы в 4% формальдегид, погрузите кончик пипетки из обожженного стекла в формальдегид и дайте эмбрионам погрузиться в жидкость.

Храните неподвижные эмбрионы при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.