Осаждение меченых CFSE опухолевых клеток и совместное культивирование CAR-экспрессирующих юркатов для оценки цитотоксичности in vitro

Чтобы начать использование серологической пипетки, удалите питательную среду из колбы T75, содержащую 70% конфлюентную культуру MDA-MB-231. Добавьте три миллилитра трипсина в колбу и инкубируйте при температуре 37 градусов с 5% углекислым газом в течение трех-пяти минут, чтобы отделить клетки от колбы. Затем для нейтрализации трипсина добавьте в колбу три миллилитра DMEM.

Соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и вращайте при 400 G в течение четырех минут. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах PBS. С помощью счетчика клеток определите концентрацию клеток.

Переложите восемь раз по 10 в пятые клетки в 15-миллилитровую пробирку и добавьте PBS, чтобы объем составил один миллилитр. Затем добавьте в пробирку два микролитра CFSE и тщательно перемешайте клеточную суспензию с помощью пипетки объемом в один миллилитр. Поместите пробирку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газа в инкубатор на 20 минут.

Затем добавьте пять миллилитров DMEM в пробирку и центрифугуйте для гранулирования ячеек, меченных CFSE. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре DMEM. После повторной оценки концентрации клеток перенесите четыре раза по 10 на пятую клетку в резервуар для реагентов объемом 25 миллилитров.

Добавьте DMEM, чтобы получился объем восемь миллилитров и смешайте клеточную суспензию с пятимиллилитровой серологической пипеткой. С помощью многоканальной пипетки перенесите по 100 микролитров клеточной суспензии в каждый ряд на левой половине черного 96-луночного планшета. Аналогичным образом добавьте суспензию нокаут-ячейки EGFR на правую половину пластины.

Чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек, перемещайте пластину вперед и назад и из стороны в сторону на платформе. Инкубируйте планшет в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе для прикрепления опухолевых клеток. Основываясь на подсчете нетрансдуцированных и экспрессирующих CAR клеток Jurkat, перенесите четыре раза по 10 в пятую часть клеток CAR-J в резервуар объемом 25 миллилитров.

Добавьте в резервуар DMEM до конечного объема в два миллилитра. Для соотношения эффекторов и опухолей 4:1 добавьте два раза по 10 к четвертой клеткам CAR-J на лунку в 100 микролитров среды вдоль стенки лунки, не нарушая прикрепленные опухолевые клетки. Затем добавьте 100 микролитров DMEM на сторону лунок, содержащих опухолевые клетки и клетки Jurkat, чтобы получить 300 микролитров объема на лунку.

Переместите планшет, как показано на рисунке, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток Jurkat на опухолевых клетках. Дайте сокультуре укорениться при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48 часов.