Получение и верификация внеклеточных ловушек нейтрофилов крыс (НВЛ)

Для начала ресуспендируйте изолированные нейтрофилы крыс в четырех миллилитрах добавленной среды RPMI в стерильной 10-сантиметровой чашке Петри. Затем добавьте четыре микролитра ПМА в суспензию нейтрофилов, чтобы спровоцировать образование НВЛ. Выдерживайте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов при 5%-ном углекислом газе.

Для отрицательного контроля добавьте четыре-пять микролитров ДНКазы1 к суспензии нейтрофилов, чтобы разрушить секретируемые НВЛ. Затем добавьте четыре миллилитра HBSS для мытья сеток. Промойте планшет четырьмя миллилитрами свежей питательной среды для каждой пробирки, чтобы отделить НЭО.

Теперь часто собирайте промывное средство в новую пробирку и пипетку, чтобы обеспечить полную ресуспендацию NET. Центрифугируйте суспензию при 300 г в течение 10 минут при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы удалить плавающие клетки. Затем соберите надосадочную среду с НЭО в новую пробирку.

Центрифугируйте суспензию НВЛ и плавающих ячеек в 24-луночной пластине с помещенными в нее 1,4-сантиметровыми стеклянными пластинами для осаждения любых плавающих клеток. Затем закрепите ячейки на покровных листах 4%PFA и приступайте к проверке наличия NET. Затем капните каплю HBSS на подставку для пробирок, покрытую парафином.

Переверните крышку в капли HBSS, чтобы вымыть ее. После промывки инкубируйте клетки в 250 микролитрах 0,5х Triton X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре для их пермеабилизации. Затем трижды промойте клетки в HBSS в течение одной минуты.

Запечатайте клетки в 10%-ной обычной ослиной сыворотке комнатной температуры в течение одного часа. Наконец, инкубируйте клетки с 70-90 микролитрами антител против крыс в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. Постирайте чехол в HBSS три раза по пять минут каждый.

Теперь инкубируйте покровный листок во вторичных антителах при комнатной температуре в течение одного часа в темноте, прежде чем промывать HBSS. Окрасьте ядра клеток и скелеты НВЛ в 70-90 микролитрах DAPI. Выполняйте стирку HBSS три раза по пять минут каждый.