Для начала промойте личинки дрозофилы стадии L3 трижды по пять минут в холодном PBS. С помощью двух пар острых щипцов проводят переднюю часть личинок и удаляют примерно 2/3 тканей тела. Держите первую 1/3 личинок одной парой щипцов и крючки для рта другой парой.
Затем втяните крючки для рта внутрь личинок до тех пор, пока личинки полностью не перевернутся. Удалите диски ног и головной мозг, чтобы получить чистую перевернутую тушу личинки с парой крыльевых дисков, прикрепленных к трахее. Переложите диски крыла в центрифужную трубку объемом один миллилитр.
Зафиксируйте диски крыльев в 4%-ном параформальдегиде, разведенном в PBS, на 45 минут при комнатной температуре при перемешивании. После фиксации промойте образцы трижды по пять минут каждый с 70% этанолом. Удалите головы, брюшную полость, ноги и крылья у мух, находящихся под наркозом, и поместите рассеченные грудные клетки в холодные PBS.
Префикс грудной клетки в 4%-ном параформальдегиде, разведенном в 1%-ном тритоне в течение 20 минут при перемешивании. Затем промойте образцы трижды по пять минут каждый с помощью PBT при перемешивании. Расположите грудные клетки на двустороннем скотче на предметном стекле и рассеките их пополам с помощью острого лезвия микротома, чтобы получить два гемитора.
Зафиксируйте гемитораций в 4% параформальдегиде на 45 минут при перемешивании. Промойте образцы дважды по 20 минут каждый с помощью PBT при перемешивании. Поместите гемиторасы в холодный PBS и с помощью щипцов тщательно изолируйте непрямые летательные мышцы от гемиторасов.
Пропитайте мышцы 70% этанолом в течение двух-семи дней при температуре четыре градуса Цельсия. После пермеабилизации промойте IFM дважды по 20 минут каждый с использованием буфера А. Затем добавьте 400 микролитров буфера для гибридизации и предварительно гибридизируйте мышцы в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в термомиксере. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленного гибридизационного буфера, содержащего зонд и первичное антитело.
Инкубируйте образцы в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов при 300 об/мин в термомиксере. После инкубации промывайте образцы трижды с использованием теплого буфера А в течение 10 минут каждый. Затем инкубируйте образцы во вторичном антителе и DAPI, разведенных в буфере А при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.
Трижды промойте образцы буфером B в течение 20 минут каждый, прежде чем перенести их на предметное стекло микроскопа. Сотрите остатки буфера B и добавьте на предметное стекло 30 микролитров монтажной среды. Наденьте на предметное стекло защитное стекло размером 18 на 18 мм и запечатайте защитное стекло лаком для ногтей.
