После включения конфокального микроскопа, оснащенного 40-кратным и 63-кратным масляными иммерсионными объективами, поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа. Чтобы получить изображение мышечных предшественников диска крыла и непрямых летательных мышц или IFM, установите DAPI с возбуждением 405 и излучением 450 нанометров. Тогда выберите Alexa Fluor 488 с возбуждением 496 и излучением 519 нм, а для зондов smFISH — Quasar 670 с возбуждением 647 и излучением 670 нм.
Найдите образец с помощью сигнала DAPI и УФ-лампы. Сохраните отснятые изображения в формате TIFF. Чтобы получить изображение взрослых мышечных стволовых клеток, установите длины волн возбуждения и излучения для DAPI и Alexa Fluor 488, как было показано ранее.
Затем установите длины волн для Alexa Fluor 555 и Quasar 670 для зондов smFISH. Найдите образец и сохраните отснятые изображения в формате TIFF. Запустите изображение J и перейдите в меню плагинов.
Выберите «Макросы», а затем «Изменить», чтобы открыть исходный код макросов. Чтобы количественно оценить пятна Mef2 smFISH у личинок, установите радиус логарифма равным 3, а качество логарифма равным 20. Затем сегментируйте Mef2 положительными ядрами с размытием два, параметром шкалы ядра 30, порогом ядра минус восемь и размером ядра 300.
Запустите макрос, выполнив команду run. Макрос автоматически загрузит все изображения из указанной папки и последовательно определит их количество. Для мышечных волокон установите логарифмический радиус равным 2,5, логарифмическое качество равным 60, размытие равным двум, параметр масштаба ядра равным 100, порог ядра равным нулю, а размер ядра равным 300.
Запустите макрос, выполнив команду run. Макрос автоматически загрузит все изображения из указанной папки и последовательно определит их количество. После анализа проверьте результаты, отображаемые в файле FISH results и файле nuclei results.
Транскрипты Mef2 и Zfh1 были равномерно обнаружены в популяции АМФ и колокализованы с белками Mef2 и Zfh1 соответственно. При более высоком увеличении АМП различают очаги сайтов транскрипции и зрелые мРНК, рассеянные в цитоплазме. Аналогичным образом, сайт транскрипции и распределение мРНК Mef2 и Zfh1 были изучены в дифференцированных взрослых IFM и ассоциированных стволовых клетках.
Макро изображения J собственного производства эффективно обнаруживает и сегментирует точки Mef2 и мышечные ядра. Количественный анализ мРНК Mef2 на ядра у взрослых ИФМ и АМП существенно не отличался. Количественная оценка распределения пятен Mef2 показала, что 92% мРНК Mef2 присутствует в цитоплазме, а 8% связаны с мышечными ядрами.
