Получение фидерных клеток iMEF и перепрограммирование трансдукции для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

1 Для начала покройте 6-луночный планшет2 двумя миллилитрами 0,2% раствора желатина на лунку. 3 Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия4 и 5% углекислого газа в течение 30 минут. 5 Затем по каплям добавьте iMEF в 15-миллилитровую пробирку 6, содержащую 10 миллилитров 7 предварительно подогретой среды человеческих фибробластов, 8 и перемешайте, осторожно перевернув пробирку.

9 Центрифугируйте клеточную суспензию при 309 G в течение трех минут. 10 И удалите надосадочную жидкость перед повторной суспензией гранулы 11 на 12 миллилитров среды фибробластов человека. 12 Поместите по два миллилитра клеточной суспензии 13 в каждую лунку покрытой желатином шестилуночной пластины.

14 И инкубировать в течение ночи при 37 градусах Цельсия 15 и 5% углекислого газа. 16 Удалите среду из инфицированного лентивирусом 17 и неинфицированного PDAC и дважды промойте клетки PBS. 18 Затем добавьте 500 микролитров трипсина для диссоциации клеток.

19 И инкубировать при 37 градусах Цельсия 20 с 5% углекислого газа и 5% кислорода 21 в течение 15 минут. 22 Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут. 23 И повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды PDAC.

24 Промойте пластину iMEF средой PDAC. 25 Затем добавьте 50 000 инфицированных лентивирусом клеток PDAC 26 в каждую лунку в пять лунок планшета iMEF и инкубируйте в течение ночи 27, как было показано ранее. 28 После приготовления перепрограммируемой среды 29 добавляют 100 микролитров основного фактора роста фибробластов, от 30 до 100 миллилитров перепрограммируемой среды.

31 На следующий день промойте клетки, растущие на кормушках iMEF, дважды 32 с предварительно подогретыми перепрограммирующими средами. 33 Затем добавьте по два миллилитра среды в каждую лунку, 34 и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия 35 с 5% углекислого газа и 3% кислорода. 36 Пройдя бассейн IPSC пять раз, 37 наблюдают за сильными колониями 38, сохраняющими морфологию, подобную ESC.

PDAC, BxPc3, 40 H6c7 и фибробласт 41 человека показали различные дни перепрограммирования 42 для формирования зрелой ESC-подобной морфологии. Было создано 43 клональные линии IPSC по 44 из каждого перепрограммирования PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 и клеток фибробластов человека. 47 Все установленные линии IPSC окрашены в положительный 48 для TRA-160, что подтверждает их перепрограммирование на плюрипотентность.