Проверка идентичности клеток МПНСТ с ранним пассажем и аллотрансплантата опухолевых клеток с ранним пассажем для демонстрации онкогенности

Для начала поместите стерильные покровные стекла в лунки шестилуночных чашек для культивирования тканей и налейте в лунки достаточное количество поли-L-лизина и раствора ламината, чтобы покрыть покровное стекло. Затем закройте тарелку полиэтиленовой пленкой, чтобы уменьшить испарение, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующее утро трижды промойте покровные стекла стерильным ПБС.

Добавьте два миллилитра клеточной суспензии и питательной среды на планшет по 10 000 клеток в каждую лунку, содержащую покровное стекло. После промывки покровных стекол ПБС зафиксируйте ячейки 4%-ным раствором параформальдегида и ПБС в течение 18 минут. Промойте покровные стекла три раза PBS в течение пяти минут перед иммуноокрашиванием.

Инкубируйте иммуноокрашенные и промытые покровные стекла в от одного до пяти микрограммов красителя Hoechst в течение 10 минут. Затем промойте покровные листы PBS еще пять минут. Установите предметные стекла с помощью смеси PBS и глицерина в равном соотношении и сделайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа.

Обработайте клетки неферментативным раствором для диссоциации клеток в течение от 30 секунд до одной минуты. Затем добавьте пять миллилитров DMEM на каждый миллилитр неферментативного реагента для диссоциации клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Центрифугируйте клетки при температуре 5G в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в концентрации от одного до двух раз по 10 шестых клеток на 100 микролитров DMEM. Положите животное на живот и простерилизуйте место инъекции 70%-ным этанолом.

Введите один-два раза по 10 шестых клеток подкожно в правый бок. Поместите мышь одну в клетку без подстилки и дайте ей восстановиться. Чтобы предотвратить переохлаждение, положите часть клетки на грелку.

Показаны изображения раннего пассажа P0 GGF beta 3 MPNST клеток раннего пассажа. Было обнаружено, что клетки являются опухолеобразующими, образуя колонии в мягком агаре и трансплантатах у мышей с иммунодефицитом.