Для начала поместите рассеченную ткань мыши в холодную клеточную культуральную среду, содержащую 5% FBS. С помощью острых ножниц для рассечения измельчайте ткань до тех пор, пока не получатся фрагменты примерно на пять миллиметров. Переложите измельченные фрагменты в С-образную трубку и добавьте один миллилитр среды для клеточных культур.
Загрузите С-образную трубку на моторизованное устройство и установите пластину держателя трубки на дно D-образной трубки. Зафиксируйте натяжные рычаги в акриловой пластине, чтобы закрепить трубки на пластине двигателя. Чтобы установить пользовательскую программу на моторизованное устройство из главного меню, нажмите синюю кнопку, чтобы выбрать пользовательский режим.
В первом меню пользовательского режима нажмите зеленую кнопку, чтобы указать продолжительность вращения вперед до 30 секунд. Затем нажмите синюю кнопку, чтобы выбрать значение на экране. Во втором меню пользовательского режима нажмите зеленую кнопку, чтобы указать продолжительность обратного вращения до 10 секунд.
Затем нажмите синюю кнопку, чтобы выбрать значение на экране. В третьем меню пользовательского режима нажмите красную кнопку, чтобы указать циклы выделения до четырех раз. Затем нажмите синюю кнопку, чтобы выбрать значение на экране.
Отрегулируйте регулятор напряжения на 200 об/мин и запустите пользовательскую программу. Далее добавьте фермент для пищеварения в четыре миллилитра холодной питательной среды, содержащей рассеченные ткани. Снова загрузите С-образную трубку в устройство и повторите пользовательскую программу, как показано ранее.
После запуска перенесите устройство с загруженными трубками в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 45 минут. Далее загрузите С-образную трубку в устройство и установите пользовательскую программу на 50 оборотов в минуту с вращением вперед на 270 секунд. Обратное вращение на 30 секунд и девять циклов.
Добавьте к образцу ЭДТА до конечной концентрации в пять миллимоляров. Установите пользовательскую программу на 100 об/мин с вращением вперед на 30 секунд. Обратное вращение до 10 секунд и зацикливание дважды.
Далее пропустите клеточную суспензию через сетчатое фильтр 70 микрометров и соберите фильтрат в пробирку объемом 50 или 15 миллилитров. Центрифугируйте собранную клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте в течение одной минуты.
Нейтрализуйте буфер для лизиса девятью миллилитрами холодного PBS. Снова центрифугируйте ячейки и повторно суспендируйте гранулу в нужном буфере или среде. Клеточная суспензия, полученная с помощью моторизованного устройства и ручной диссоциации, продемонстрировала сопоставимую жизнеспособность клеток и урожайность в тканях легких, почек и сердца мыши.
Иммунные клеточные популяции, такие как Т-клетки и дендритные клетки, не были существенно затронуты протоколом изоляции. Экспрессия поверхностных маркеров также показала сходные частоты изолированных Т-клеток в средней интенсивности флуоресценции для маркера презентации антигена MHC II в дендритных клетках между ручным и аппаратным выделением.
