Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия высокого разрешения CRISPR/Cas9-опосредованных нокаутных клеток HENP-E HeLa

Для начала возьмем пластину дикого типа и мутантные клетки HeLa CENP-E, растущие на покровном листе. Зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом и фиксирующим раствором PBS при комнатной температуре на 10 минут. Затем погрузитесь в PBS на два раунда по пять минут каждый.

Затем проникните в клетки 0,25% Triton X-100 и PBS при комнатной температуре в течение 10 минут. Погрузите их в PBS на два раунда по пять минут каждый. Продолжайте блокировать клетки 1% BSA PBS с 0,1% Tween 20 при комнатной температуре в течение одного часа.

Разбавьте первичные антитела в 1% BSA и PBST и инкубируйте образцы при четырех градусах Цельсия в течение 12 часов. Откажитесь от первичных растворов антител. Затем промойте клетки три раза по пять минут каждый PBS.

Добавьте в клетку разведенные вторичные антитела и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов. Далее отбраковывайте вторичные антитела. Затем промойте клетки PBS трижды по пять минут каждая.

Окрашивайте ядра с помощью DAPI при комнатной температуре в течение пяти минут. Закрепите слайды с помощью монтажного носителя и заклейте их лаком для ногтей. Наблюдайте за флуоресцентными изображениями с помощью сканирующего конфокального микроскопа, оснащенного объективом с числовой апертурой 1,40 с 63-кратным увеличением, и записывайте их для дальнейшего анализа.

Иммунофлуоресцентное окрашивание контрольной и CENP-E мутантной групп показало, что интенсивность флуоресценции белков CENP-E была полностью нокаутирована в клетках мутантного клона 1 CENP-E и значительно снижена в клетках мутантного клона 3 CENP-E. Соотношение метафазных клеток с хромосомным смещением увеличивалось в клонах 1 и 3 по сравнению с контрольными клетками. Между тем, соотношения метафазных клеток значительно увеличились в клетках Клона 1 и Клона 3.

Кроме того, соотношение интерфазных клеток незначительно увеличивалось в группах клонов 1 и 3 после делеции CENP-E, по сравнению с контрольной группой. Частота профазных, анафазных и телофазных клеток была незначительно снижена после делеции CENP-E, в то время как скорость метафазных клеток увеличилась после делеции CENP-E.