Хромосомное препарирование и анализ кариотипа CRISPR/Cas9-опосредованных CENP-e нокаутных клеток HeLa

Для начала возьмите культуру клеток дикого типа и мутантных клеток HENP-E и добавьте 300 наномолярного колхицина перед инкубацией в течение пяти часов. Затем инкубируйте клетки с 0,25% трипсина-ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут и соберите клетки в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Далее центрифугируют клетки при 1000 G в течение пяти минут при комнатной температуре, отбрасывают надосадочную жидкость и добавляют 1,2 миллилитра 0,075 молярного раствора хлорида калия.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. По окончании инкубации центрифугируют клетки, отбрасывают надосадочную жидкость, а для приставки добавляют 0,2 миллилитра раствора фиксатора. Осторожно перемешайте в течение одной минуты, затем соберите гранулы клеток, как показано ранее, и добавьте 1,5 миллилитра фиксирующего раствора комнатной температуры на 10 минут.

После центрифугирования клеток и отбрасывания надосадочной жидкости добавьте 0,6 миллилитра фиксирующих растворов для создания клеточной суспензии. Осторожно капните три-пять капель клеточных взвесей с высоты от 35 до 40 сантиметров на ледяные горки. Немедленно высушите предметные стекла с помощью спиртовой лампы и окрасьте их 10% поддерживающим раствором Giemsa в течение семи минут.

Промойте предметные стекла проточной водой в течение двух минут, затем исследуйте образцы с помощью светового микроскопа, оснащенного объективом Plan Fluor с 40-кратным увеличением 0,75 числовой апертуры. Анализ кариотипа выявил снижение числа хромосом в мутантных клетках HeLa CENP-E по сравнению с клетками дикого типа.