Для заделки ячеек парафином установите парафиновую машину на 58 градусов Цельсия. С помощью плоскогубцев перенесите мембранные вставки в чистые лунки стерильной 24-луночной пластины. Добавьте 500 микролитров 37% буферизованного формалина и PBS над фильтром, и один миллилитр ниже фильтра.
Закройте крышку и оставьте тарелку в вытяжном шкафу на два часа. После того, как собственная пластинка будет отделена от мембранного вкладыша, переложите слизистую оболочку кишечника в стакан, содержащий 25 миллилитров 35% этанола, и инкубируйте в течение 10 минут. После обезвоживания с возрастающей концентрацией этанола поместите образцы в 50 миллилитров ксилола или гистологического очищающего агента на 10-20 минут.
Как только образцы станут прозрачными, поместите их в держатель кассеты из металлической ткани и погрузите в жидкий парафин в нагретую машину. Через 45 минут с помощью микротома вырежьте четыре микронных среза. Поместите срезанную часть на горки и просушите их в духовке при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.
Приемлемая трехмерная модель слизистой оболочки, эквивалентная кишечному эквиваленту, состоит из клеток Caco-2, сформированных в плотном и регулярном монослое над собственной пластинкой, богатой внеклеточным матриксом. К неприемлемым моделям относятся модели с чрезмерным ростом, дезорганизацией эпителиальных слоев, мальформацией или отсутствием образования эпителиального слоя. Провоспалительное действие пшеничного белка с высоким содержанием клейковины нарушало клеточный монослой и уменьшало толщину эпителиального слоя по сравнению с контрольной группой.
Содержание белка окклюдина было достоверно выше в контрольной группе, чем в группе, подвергшейся воздействию белка глютена. Окрашивание моноцитов U937 с помощью CD14 и CD11b показало, что белок пшеницы с высоким содержанием клейковины активирует моноциты, индуцирует их миграцию и дифференцировку в макрофаги. Под воздействием липополисахаридов клетки Caco-2 увеличивали выработку слизи и высвобождение маркера воспаления.
