Сбор, децеллюляризация и пепсиновое расщепление тканей легких крупного рогатого скота для образования гидрогеля децеллюляризованного внеклеточного матрикса легкого

1 Для начала удалите замороженные ткани легких крупного рогатого скота2 от 80 градусов Цельсия 3 и дайте им оттаять при комнатной температуре. 4 Рассеките ткань с помощью стерильных скальпелей и ножниц 5 удалите трахею и хрящевые дыхательные пути, 6 затем измельчите ткань на мелкие кусочки. 7 Промойте ткань три раза 8 ультрачистой водой 9, содержащей 2% пенициллина и стрептомицина.

10 Погрузите образец измельченной ткани 11 в 2%-ный раствор йода на одну минуту, 12 затем выполните два последовательных промывки 13 в стерильной дистиллированной воде. 14 Переложите кусочки салфетки в трубку объемом 50 миллилитров 15 до отметки 15 миллилитров. 16 Заполните трубку доверху дистиллированной водой 17 и заморозьте ее в жидком азоте на две минуты.

18 Затем немедленно переложите трубку в стакан 19, содержащий воду с температурой 37 градусов Цельсия, на 10 минут. 20 После пяти циклов замораживания и размораживания 21 инкубируют образец в 30 миллилитрах 22 раствора ДНКазы в течение одного часа 23 при 37 градусах Цельсия при постоянном перемешивании. 24 Заморозьте влажные децеллюляризованные образцы внеклеточного матрикса 25 при 80 градусах Цельсия на 24 часа.

26 Переложите замороженные образцы в лиофилизатор 27 и работайте в режиме сушки под вакуумом 28 в течение трех-четырех дней до полного высыхания. 29 После сублимационной сушки 30 измельчите образцы в мелкий порошок 31 в измельчающем аппарате, содержащем сухой лед. 32 Обрабатывайте легочные ткани 1% Triton-X-100 33 в течение трех дней при щадящем вращении 34 при четырех градусах Цельсия, 35 меняя раствор каждые 24 часа.

36 Инкубируйте образец в растворе ДНКазы 37 в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия при постоянном перемешивании. 38 Промойте салфетку дистиллированной водой 39 в течение трех дней при постоянном скручивании, 40 пополняя воду каждые 24 часа. 41 После последней промывки выполните лиофилизацию и криоизмельчение 42, как было показано ранее.

43 Переварить 15 мг на миллилитр 44 порошкообразных децеллюляризованных образцов внеклеточного матрикса 45 в одном миллиграмм на миллилитр раствора пепсина 46 при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 48 часов. 47 Поддерживайте pH раствора на уровне два для эффективного пищеварения. 48 Центрифугируйте ткань, расщепите при 5000 г в течение 10 минут 49 и удалите надосадочную жидкость.