Для начала возьмите пробирку с органоидами, полученными от пациента, или суспензию PDO в равном количестве экстрактов базальной мембраны, или BME. С помощью пипетки объемом 20 микролитров засейте пять микролитровых куполов в центр каждой лунки предварительно нагретой 96-луночной пластины. Засеяв все лунки, поместите крышку на тарелку и аккуратно переверните ее.
Инкубируйте перевернутую пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут в инкубаторе для культивирования тканей, чтобы купола затвердели. Переверните тарелку так, чтобы крышка была обращена вверх. Затем снова инкубировать.
После добавления флуоресцентных красителей и лекарственных препаратов в пластины, содержащие ЗОП. Поместите табличку в пятую цитату. Запустите программное обеспечение Gen5 и в окне диспетчера задач выберите ручной режим имидж-сканера и нажмите «Захват сейчас».
В настройках укажите объектив, фильтр, формат микропланшета и тип сосуда, выберите «Использовать крышку» и «Использовать меньшую скорость носителя» и нажмите «ОК». Затем выберите интересующий вас колодец. Выберите канал светлого поля, нажмите на «Автоэкспонирование» и отрегулируйте параметры по мере необходимости.
Далее, чтобы настроить стек Z, разверните вкладку режима изображения, выберите стек Z и настройте фокус с помощью стрелок корректировки курса, пока все PDO не окажутся вне фокуса. Установите эту точку в качестве нижней части стека Z и повторите в обратном направлении, чтобы установить верх. После этого настройте флуоресцентные каналы, открыв этап редактирования изображения.
В разделе Каналы выберите желаемое количество каналов, назначьте один канал для светлого поля и дополнительные каналы для каждого флуоресцентного канала. Закройте окно, нажав OK, измените выпадающее меню на GFP, чтобы установить экспозицию для первого флуоресцентного канала, нажмите «Автоэкспонирование» и отрегулируйте настройки экспозиции на вкладке «Экспозиция», чтобы уменьшить фоновый сигнал. Чтобы скопировать настройки экспозиции на вкладку режима изображения, нажмите значок копирования, а затем нажмите «Редактировать шаг изображения», чтобы открыть новое окно.
В канале GFP щелкните значок буфера обмена в строке экспозиции, чтобы добавить в канал настройки освещения, времени интеграции и усиления камеры. Теперь нажмите на иконку камеры и выберите «Предварительная обработка изображения» в разделе «Добавить шаг обработки». На вкладке светлого поля снимите флажок «Применить предварительную обработку изображения».
Для каждой вкладки флуоресцентного канала убедитесь, что установлен флажок Применить предварительную обработку изображения. Отмените выбор, используйте те же параметры, что и первый канал, а затем нажмите кнопку «ОК», чтобы закрыть окно. Теперь нажмите на проекцию Z под шагом обработки добавления, при необходимости отрегулируйте диапазон среза и закройте окно, нажав кнопку ОК.
Чтобы настроить протокол для кинетической визуализации, на панели инструментов нажмите на набор изображений и в выпадающем меню выберите «Создать эксперимент из этого набора изображений». Нажмите на опции под другим заголовком и поставьте галочку в поле «Прерывистая кинетическая процедура». В поле Предполагаемое общее время введите время выполнения эксперимента.
Закройте окно, нажав кнопку ОК. Кроме того, установите расположение пластин и температурный градиент в это время. Проверьте шаги по сокращению данных, щелкнув по окнам.
Затем перейдите к файлу и нажмите «Сохранить протокол», как на панели инструментов. Выберите место сохранения. Введите имя файла и нажмите «Сохранить».
Чтобы начать кинетическую визуализацию, загрузите протокол в программное обеспечение для планирования bio spa on demand и выберите доступный слот. На вкладке «Информация о процедуре» выберите в меню «Пользователь». Рядом со слотом протокола нажмите «Выбрать» и выберите «Добавить новую запись».
Теперь нажмите кнопку «Выбрать» рядом со слотом протокола. Нажмите кнопку «Открыть» для навигации и импорта протокола в программное обеспечение для планирования. Введите требуемое время визуализации для пластины и нажмите OK, чтобы закрыть окно.
В разделе Интервал введите желаемую частоту визуализации, выберите расписание, пластину или сосуд для запуска последовательности проверки пластин, нажмите Да, чтобы принять это расписание.
