Для начала поместите семена Brassica napus DH12075 в микропробирки. Чтобы обезжирить семена, добавьте в микропробирку воду и 0,1% моющего средства и встряхивайте в течение 60 секунд. Теперь промойте семена водой, а затем добавьте 70% этанола в течение 60 секунд.
Далее поместите семена в 10% раствор гипохлорита натрия и встряхните в течение 20 минут. После удаления отбеливателя четыре раза промойте семена стерильной водой по 60 секунд каждый. Поместите семена в чашку Петри, содержащую среду для проращивания семян.
Холодную стратификацию семян при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи, прежде чем переместить блюдо в помещение для выращивания. Через пять дней пересадите рассаду в ящик для выращивания растений, содержащий питательную среду для растений. Инокулировать менее Ti agrobacterium tumefaciens C58C1, несущую волосистую корневую плазмиду PRIA 4B в пяти миллилитрах LB-среды.
Выращивайте культуру в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия, пока она не достигнет оптической плотности на уровне 600 нанометров 0,9 к одному. Перенесите бактериальный инокулюм в шприц. С помощью иглы 26-го калибра, установленной на шприце, проколите гипокотиль 18-дневного саженца на высоте примерно одного сантиметра над питательной средой.
Введите в рану примерно 50 микролитров инокулюма и поцарапайте ткань на поверхности гипокотиля. Верните растение в помещение для выращивания при температуре 21 градус Цельсия на две-четыре недели. Далее срежьте из гипокотила мозоль с появившимися волосистыми корнями.
Поместите каллус с волосистыми корнями на чашку Петри, содержащую среду для роста волосистого корня и антибиотики для подавления роста агробактерий. Заклейте чашку газопроницаемой лентой перед инкубацией при температуре 24 градуса Цельсия. После инкубации изолируйте волосистые корни от каллуса и перенесите отдельные корни в среду для роста волосистых корней.
В качестве альтернативы, чтобы получить сложное растение, состоящее из побегов дикого типа и трансгенных волосистых корней, удалите родные корни растения. Затем перенесите растение с появляющимися волосистыми корнями в культуральный ящик, содержащий питательную среду для растений и антибиотики для подавления роста агробактерий.
