Окрашивание нейтрофилов человека и подготовка планшета для анализа нейтрофилов для анализа живых клеток

После выделения нейтрофилов из периферической крови человека их ресуспендировали в среде RPMI 1640 в центрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров. Добавьте один микролитр мембранной проницаемой красной ДНК к 1,5 миллилитрам нейтрофильной суспензии и инкубируйте в темноте в течение пяти минут. Центрифугируйте суспензию нейтрофилов при 2 500г в течение пяти минут при комнатной температуре.

После центрифугирования извлеките пробирку, содержащую гранулированные нейтрофилы, и аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте нейтрофилы в одном миллилитре RPMI и снова центрифугируйте его. После последнего промывки ресуспендируйте нейтрофилы в одном миллилитре РПМИ.

Добавьте в гемоцитометр небольшой объем суспензии нейтрофилов и посчитайте их под микроскопом. Разбавляют суспензию нейтрофилов в 1,5 раза в 10 до пятой нейтрофилов на миллилитр с помощью РПМИ. Добавьте четыре микролитра от одного до 100 предварительно разведенного мембранного непроницаемого зеленого красителя ДНК к одному миллилитру суспензии нейтрофилов.

Дозируйте 100 микролитров суспензии нейтрофилов на лунку в прозрачную культуру тканей, обработанную 96 луночным планшетом. Добавьте в соответствующие лунки 100 микролитров РПМИ, содержащих стимулирующие реагенты с ингибитором или без него. Поместите планшет в систему анализа живых клеток, размещенную в инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа.