Для начала приготовьте один миллиграмм на миллилитр раствора коллагена внутривенно в воде и добавьте 95 микролитров этого раствора в каждую лунку 10-луночного предметного стекла нижней камеры визуализации. Инкубируйте предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия от 30 минут до двух часов, чтобы покрыть лунки. Из культивируемых 3D-органоидов кишечника человека удалить поддерживающую среду WRNE из лунок через пять-семь дней после последнего пассажа.
Затем добавьте 500 микролитров 1xPBS, содержащего 0,5 миллимолярной ЭДТА, на лунку. Используя предварительно закодированный наконечник объемом один миллилитр, осторожно отсоедините BMM от пластины. Перелейте суспензию в заранее закодированную коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Промойте каждую лунку дополнительными 500 микролитрами раствора PBS EDTA. Центрифугируют суспензию и удаляют надосадочную жидкость и остаточный BMM. Затем используйте предварительно закодированный наконечник, чтобы повторно суспендировать гранулу в трех миллилитрах PBS, содержащей пятимиллимолярную ЭДТА.
Снова центрифугу и ресуспендировать в двух миллилитрах буфера для ферментативной диссоциации. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте три миллилитра CMGF с 10%-ным FBS и аккуратно перемешайте.
Центрифугируйте и добавьте один миллилитр CMGF-в гранулу. Энергично пипетируйте смесь от 80 до 100 раз, чтобы разбить органоиды на отдельные клетки. Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре среды WRNE.
Получают количество клеток и разбавляют клеточную суспензию до 1,25 умножить на 10 к пяти клеткам в 100 микролитрах. Далее извлеките коллагеновый раствор из заранее подготовленной пластины, избегая касания дна лунки. Затем добавляют 100 микролитров приготовленного клеточного раствора на лунку.
Инкубируют в течение 24 часов в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия. Заменяйте среду 100 миллилитрами дифференцирующей среды на лунку через каждые 24 часа до слияния. После этого монослои готовы к последующему применению.
