Для начала настройте эпифлуоресцентный микроскоп. Перед визуализацией предварительно нагрейте инкубатор Stage Top до 37 градусов Цельсия и запустите увлажненный углекислый газ в камере со скоростью 0,02 литра в минуту. Затем поместите предметное стекло с зараженными монослоями в камеру инкубатора и закройте крышкой.
С помощью объектива 20X при ярком освещении выберите координаты X и Y полей зрения в пределах монослоя. Оптимизируйте параметры визуализации и получите изображение, используя длину волны возбуждения 488 нанометров. Чтобы свести к минимуму фототоксичность, установите источник света на 50% мощности с временем экспозиции 50 миллисекунд.
Убедитесь, что ни один пиксель не насыщен, и настройте так, чтобы обнаруживать весь динамический диапазон флуоресцентного датчика кальция. Настройте цикл визуализации и получите изображение по каждой выбранной координате X и Y в течение одной минуты, а затем непрерывно выполняйте изображение в этом цикле. Для флуоресцентно помеченных вирусов каждый 10-й цикл получают изображение по соответствующему каналу.
При использовании нефлуоресцентных вирусов выполняйте аминофлуоресцентное окрашивание после визуализации. Сначала зафиксируйте монослои 100 микролитрами формальдегида. После инкубации снять фиксатор и погасить 100 микролитрами 50 миллимолярного хлорида аммония в течение 10 минут.
После удаления хлорида аммония пермеабилизацию монослоев 100 микролитрами 0,1% Triton X-100 в течение одного часа при комнатной температуре. Затем раствор снимают, добавляют 100 микролитров блокирующего раствора и выдерживают в течение одного часа. Затем удалите блокирующий раствор и добавьте 100 микролитров первичных антител, введенных в 1X PBS.
Инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия при легком покачивании. После инкубации удалить первичные антитела и трижды промыть 1X PBS. Наконец, добавьте 100 микролитров флуоресцентных конъюгированных вторичных антител, введенных в заблуждение в 1X PBS.
Чтобы предотвратить фотообесцвечивание, защитите планшет от света и выдержите в течение двух часов при комнатной температуре. После инкубации удалить вторичные антитела и окрасить образцы раствором DAPI. Затем поместите фиксированные монослои в 100 микролитров 1X PBS для визуализации.
Поместите предметное стекло обратно на столик микроскопа. Перезагрузите координаты X и Y из прогона визуализации в реальном времени и отобразите каждую многоточечную точку на канале, соответствующую вторичному антителу, используемому для окрашивания. Соотноситесь с изображениями, полученными в режиме реального времени, чтобы убедиться, что в них запечатлены одни и те же точки.
С помощью этого метода ротавирусную инфекцию визуализировали в монослое hIO после оценки этого монослоя. Для рекомбинантных штаммов ротавируса, экспрессирующих флуоресцентные белки, таких как mRuby, инфекция была верифицирована во время визуализации в реальном времени. В то время как при использовании штамма, не экспрессирующего маркер, инфекция выявлялась иммунофлюоресценцией после визуализации.
