Индуцирование 3D нейронного формирования сетчатки из культивируемых H9-эмбриональных стволовых клеток для терапии на основе стволовых клеток

Для начала разморозьте и культивируйте H9-эмбриональные стволовые клетки в поддерживающей среде, содержащей Y-27632. В нулевой день, когда колонии станут на 70% сливающимися, промойте их 2 миллилитрами DPBS, затем инкубируйте клетки с 0,5 миллилитрами раствора для диссоциации клеток, содержащим 20 микромолей на литр Y-27632. Чтобы прервать пищеварение, добавьте 3 миллилитра поддерживающей среды, содержащей 20 микромолей на литр Y-27632.

Чтобы гранулировать клетки, центрифугируйте пробирку при 190 G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре химически определенной среды, не содержащей фактора роста, с Y-27632. После подсчета клеток добавьте 1,2 миллиона клеток к 10 миллилитрам химически определенной среды без фактора роста и хорошо перемешайте.

Затем дозируйте по 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной конической нижней пластины. Инкубируйте в увлажненной атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. Чтобы вызвать образование сетчатки на шестой день, добавьте среду, содержащую BMP4, в каждую лунку 96-луночного планшета с V-образным дном и снова инкубируйте.

На девятый, 12 и 15 день замените половину отработанного носителя на свежий носитель без БМП4. На 18 день аккуратно перенесите сформированные эмбриоидные тельца в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. После естественного осаждения эмбриоидных тел аккуратно удалите надосадочную жидкость и промойте их средой для дифференцировки нервной сетчатки.

Затем поместите эмбриоидные тельца в шестилуночную пластину с низкой абсорбцией и снова инкубируйте пластину. На 21-й день снимки Brightfield показали непрерывную нейроэпителиальную структуру в нервной сетчатке, созданную с помощью этого метода. Успешность индукции сетчатки была значительно выше, а органоиды сетчатки, полученные с использованием этого протокола, были схожи по размеру и морфологии по сравнению с другими методами.