Выполните протокол в шкафу биобезопасности на усыпленной мыши, надлежащим образом выбритой и продезинфицированной 70% этанолом. С помощью ножниц сделайте поверхностный разрез размером 0,5 дюйма в животе животного. Разрежьте продольно по средней линии в сторону шеи и нижней части живота.
Кроме того, сделайте боковые надрезы, чтобы открыть кожу. С помощью тупых щипцов аккуратно отделите кожу от окружающих тканей, при этом обойдя туловище животного, разрезая кожу сбоку вокруг шеи и нижней части живота. Осторожно поместите кожу дермой вниз в 100-миллиметровую тарелку для культуры тканей.
И следите за тем, чтобы кожа была максимально растянутой. Добавьте в тарелку шесть миллилитров раствора Dispase, следя за тем, чтобы кожа была полностью покрыта. Затем накройте тарелку.
Оберните тарелку парапленкой. Выдержите тарелку при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы эксплант расплющился. На следующий день с помощью пипетки удалите жидкость из пластины, содержащей изолированную кожу.
Затем с помощью щипцов отделите дерму от эпидермиса, удалив при этом из него видимую жировую ткань. И поместите изолированную дерму в планшет для культуры чистых тканей. Добавьте один миллилитр DMEM, содержащий 1X раствор антибиотика-антимикотика, в дерму в культуральной пластине.
Наклоните пластину, чтобы жидкость скопилась с одной стороны тарелки. Затем измельчите дерму на кусочки размером от одного до двух квадратных миллиметров. И переложите их в новую 50-миллилитровую коническую трубку.
Добавьте в пробирку 10 миллилитров раствора коллагеназы II типа. Инкубируйте его в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия с непрерывным перемешиванием при 30-50 оборотах в минуту, чтобы переварить дерму. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр 70 микрон.
И центрифугируем его при 250г в течение пяти минут. После выброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 10 миллиметрах DMEM, содержащего антибактериально-антимикотический раствор. Перед центрифугированием отфильтруйте суспензию ячеек через сетчатый фильтр 40 микрон, как было показано ранее.
Ресуспендируйте полученную клеточную гранулу в одном миллилитре полной среды LEC. Затем поместите клетки в полную среду LEC в 60-миллиметровую тканевую культуральную пластину, покрытую коллагеном. Заменяйте фильтрующий материал каждые два дня, дважды промывая ячейки PBS и добавляя свежий фильтрующий материал LEC.
Изображения с малым увеличением клеток, выделенных из мышиной дермы, показали смешанную популяцию клеток.
