Очищение мышиных лимфатических эндотелиальных клеток

Чтобы очистить клетки лимфатического эндотелия мочи, используйте клетки, выделенные из мышиной дермы после того, как они достигнут примерно 80-90% со-бегучести, начните с промывки предварительно закодированных магнитных шариков в магнитном сепараторе с использованием одного миллилитра раствора для покрытия магнитных шариков. Ресуспендируйте гранулы в 150 микролитрах DMEM, содержащем 0,1% BSA. Затем дважды промойте клетки в 60-миллиметровом планшете для культуры тканей PBS.

Смешайте 50 микролитров конъюгированных гранул антител с тремя миллилитрами DMEM, содержащим 0,1% BSA, и добавьте его в клетки. Запечатайте чашку биопленкой, затем выдержите чашку на шейкере, перемешивающем при 10 оборотах в минуту при комнатной температуре, ровно 10 минут. Выбросьте среду перед однократной промывкой клеток PBS.

Быстро осмотрите клетки, чтобы убедиться в наличии колоний LEC на пластине. Добавьте в клетки один миллилитр трипсина ЭДТА и инкубируйте в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия для трипсинизации клеток. Осмотрите клетки на предмет успешной отслойки клеток.

После нейтрализовать раствор двумя миллилитрами полной среды LEC. Переложите клеточный раствор в стерильную полипропиленовую трубку объемом пять миллилитров. С помощью магнитного сепаратора промойте клетки тремя миллилитрами DMEM, содержащим 0,1% BSA, чтобы удалить несвязанные клетки.

Ресуспендируйте оставшиеся связанные с шариками клетки в полной среде LEC и наложите их на 60-миллиметровые планшеты для культуры тканей, покрытые коллагеном. Светлая и флуоресцентная визуализация легко идентифицировали LYVE1-положительные лимфатические эндотелиальные клетки после очистки и показали несколько прикрепленных к ним шариков. Через 24 часа после очистки клетки показали низкую конфлюенцию, в то время как через семь дней после очистки они были очень плавными.