Для начала проведите проточную цитометрию на клетках Trypanosoma brucei, экспрессирующих фтор. Откройте новый макет и перетащите полученные файлы FCS в окно компоновки. Для стробирования живых ячеек выберите элемент управления wild-type unstained, чтобы открыть окно.
Проанализируйте данные с помощью гистограмм на канале YL2H или RL2H. В этом случае используйте гистограмму YL2H, так как образцы были окрашены йодидом пропидия. Затем установите биссектрисный вентиль для разделения живых и мертвых клеток, обозначив левый вентиль как живой, а правый — как мертвый.
Примените и отрегулируйте этот затвор для всех образцов. Убедитесь, что вентиль нарисован правильно, просмотрев его на нескольких выборках в наборе данных. На незапятнанном элементе управления дикого типа дважды щелкните по живому гейту.
Установите ось X точечной диаграммы в область прямого рассеяния, а ось Y — в область бокового рассеяния. Затем используйте инструмент Ворота полигона, чтобы очертить популяцию клеток, подписав ее ячейки. Исключите мусор или умирающие клетки и агрегаты, соблюдая осторожность в отношении их типичного положения на точечной диаграмме.
Примените затвор ячеек под активным затвором для всех образцов, убедившись, что он покрывает вероятную популяцию клеток для всех образцов. Дважды щёлкните по воротам ячеек на элементе управления неокрашенного дикого типа, чтобы просмотреть события внутри этого элемента управления. Чтобы настроить точечную диаграмму, задайте ось X для области прямого рассеяния, а для оси Y — высоту прямого рассеяния.
Определите диагональное распределение одиночных клеток на этой точечной диаграмме, отличая их от дублетов. Используйте инструмент Многоугольный гейт, чтобы обвести синглетные события, назвав эти синглеты. Примените синглетный вентиль под вентилем ячеек для всех выборок, убедившись, что он исключает дублеты при включении синглетов, и при необходимости отрегулируйте вентиль для разных выборок.
На неокрашенном контрольном образце дикого типа дважды щелкните по затвору синглетов. Измените ось X точечного графика на BL1H, а ось Y на VL2H. С помощью инструмента Многоугольный вентиль нарисуйте диагональный вентиль для захвата флуоресцентных ячеек Fluorine-2 в VL2 и BL1.
Обозначьте этот гейт как pHL положительный. Примените положительный затвор pHL под синглетным затвором для всех образцов. Отрегулируйте затвор pHL так, чтобы он охватывал клетки с более высокой интенсивностью флуоресценции, чем автофлуоресцентные клетки в контроле дикого типа.
Чтобы экспортировать статистику, нажмите на редактор таблицы, затем на панель редактирования и, наконец, выберите добавить столбец. Включите столбцы для общего количества необработанных результатов, положительного числа pHL, частоты общего числа в реальном времени, положительной частоты pHL родителя, pHL положительной медианы VL2H и pHL положительной медианы BL1H. Чтобы настроить параметры экспорта в табличном редакторе, задайте для параметра отображение значение файла, а для текста — значение CSV.
Выберите место назначения и имя файла, затем нажмите кнопку Создать таблицу. Постепенное легкое закисление наблюдалось с течением времени в ответ на голодание, которое выходило на плато в течение 90 минут. После повторного введения глюкозы, как показано зеленой линией, гликосомальный рН вернулся к уровням до голодания через 30 минут, что позволяет предположить, что гликосомальный рН является динамическим и регулируемым в ответ на глюкозу.
