Процедура проточной цитометрии для измерения относительного pH гликосомы у живых Trypanosoma brucei

Для начала запустите программное обеспечение проточного цитометра. Откройте новый эксперимент. Добавьте желаемое количество образцов и назовите их.

Затем настройте гистограмму канала YL2-H или RL1-H, точечную диаграмму области прямого рассеяния в зависимости от области бокового рассеяния, точечную диаграмму области прямого рассеяния в зависимости от высоты прямого рассеяния и точечную диаграмму канала BL1-H в сравнении с VL2-H. Поместите неокрашенные контрольные клетки дикого типа Trypanosoma brucei в отверстие для введения образца и отрегулируйте положение предметного столика. Чтобы уменьшить размер файла, снимите флажки с каналов, которые не предназначены для записи.

Начните с низкой скорости потока, чтобы можно было внести коррективы. Затем нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать сбор данных. Точно настройте напряжение YL2 или RL1 так, чтобы выровнять основной пик в пределах 10 с третью и 10 с четвертой единицей относительной интенсивности флуоресценции.

Отрегулируйте напряжения прямого и бокового рассеяния, чтобы более 90% событий находились в пределах диапазона точечной диаграммы. Установите порог прямого рассеяния, чтобы исключить мусор, не пропуская жизнеспособные ячейки. Измените настройки каналов VL 2 и BL 1, чтобы расположить первичный пик контроля неокрашенного дикого типа в пределах от 10 до 2-10 до четвертых единиц относительной интенсивности флуоресценции.

Щелкните Запись и измерьте не менее 10 000 событий. Затем поместите первый индуцированный образец трипаносомы, экспрессирующий pHluorin, окрашенный либо йодидом пропидия, либо тиазолом красным, на отверстие для инъекции образца. Опять же, начните сбор данных при низкой скорости потока после выполнения промывки.

Отслеживайте каждый график, чтобы убедиться, что более 90 % событий записаны правильно, а каналы VL2-H и BL1-H не перегружены. Сохраните данные из каждого образца в формате FCS и подготовьтесь к анализу.