Измерение динамических изменений рН гликосом у живой Trypanosoma brucei

Метаболизм глюкозы имеет решающее значение для Trypanosoma brucei, но мало что известно о том, как клетки чувствуют и реагируют на изменение уровня глюкозы в окружающей среде. Мы разработали паразиты, экспрессирующие биосенсор pH, который позволяет нам контролировать гликозомальный pH у живых паразитов, что поможет в понимании динамических реакций паразитов на колебания питательных веществ. Проблемой для этого эксперимента было бы наличие проточного цитометра, оснащенного считывателем микротитров, а также соответствующих наборов фильтров для измерения флуоресценции биосенсора.

Кроме того, T.brucei является микроорганизмом второй группы риска, поэтому цитометр должен быть размещен на объекте второго уровня биобезопасности. Было обнаружено, что уровень рН гликосом может влиять на гликолиз, поскольку гексокиназа и фосфофруктокиназа чувствительны к рН. Тем не менее, датчики pH, которые использовались ранее, не были точно нацелены на гликосому в форме кровотока.

Понадобился более совершенный инструмент для изучения взаимосвязи между гликосомным рН и гликолизом на этой стадии жизни паразита. Датчик pHluorin2-PTS1 — это инструмент, который лучше локализуется в гликосоме, чем химические датчики pH на этом этапе жизни. Это удобно для пользователя, так как вам нужно только вызвать экспрессию датчика pH в течение ночи, и клетки будут вырабатывать и локализовать pHluorin2 в гликосоме.

Использование проточной цитометрии для измерения pHluorin2 увеличивает пропускную способность и улучшает статистические измерения по сравнению с микроскопией.