1 После вскрытия scBAT2 от усыпленной мыши, 3 немедленно поместите ткань в микроцентрифужную пробирку. 4 Проткните стерильной иглой отверстие в верхней части пробирки 5 и защелкните заморозьте в жидком азоте. 6 Замочите пестик и тонкий шпатель в жидком азоте.
7 Вылейте образец замороженной ткани 8 из микроцентрифужной пробирки в раствор. 9 Добавьте в ступку небольшое количество жидкого азота 10 и тщательно измельчите ткань пестиком 11 до полного измельчения. 12 С помощью тонкого шпателя соскребите и перенесите 13 измельченную ткань обратно в микроцентрифужную пробирку.
14 После того, как вся ткань перенесена, 15 добавьте 500 микролитров раствора для выделения РНК в пробирку 16 и обрабатывайте ультразвуком в течение 30 секунд с помощью пеллетного пестика. 17 Затем с помощью шприца пипетка пипеткой вверх и вниз 10 раз 18 для дальнейшего вскрытия ткани, 19 следя за тем, чтобы не было видно твердых частиц. 20 Добавляйте 250 микролитров хлороформа и время от времени 21 в течение пятиминутной инкубации при комнатной температуре.
22 Центрифугируйте образцы при 21 000 G в течение 20 минут 23 при четырех градусах Цельсия. 24 Перенесите верхний водный слой в новую трубку 25 и добавьте эквивалентное количество 70% этанола. 26 Перелейте 500 микролитров лизата 27 в связующую колонку.
28 Центрифугируйте при 18 000 G в течение 60 секунд 29 и выбросьте фильтрат. 30 Для обратной транскрипции добавьте от 0,5 до 1 микрограмма 31 РНК, разведенной в воде, обработанной DEPC, в полоску для ПЦР-пробирки. 32 Затем разбавьте CDNA до 250 нанограмм на микролитр 33 с использованием воды, обработанной DEPC, и настройте количественную ПЦР.
34 Уровни экспрессии маркерных генов, участвующих в опосредствовании функции scBAT, были относительно схожими 36 между scBAT и межлопаточной летучей мышью.
