Массовые реакции бесклеточной экспрессии с малыми униламеллярными везикулами (SUV) для применения в синтетических клетках

Для начала выдуйте легкую струю аргоннского напитка в стеклянный флакон, содержащий липиды POPC, осторожно вращая флакон. Когда липиды высохнут в виде пленки на дне флакона, неплотно закройте его крышкой, затем переложите в осушитель. Через час добавьте 0,5 миллилитра сверхчистой деионизированной воды для растворения липидной пленки.

Вортсируйте раствор в течение двух минут. Далее замочите две опоры фильтра и деионизируйте воду. Разместите их на каждой из внутренних мембранных опор.

Затем поместите 100-нанометровый поликарбонатный фильтр между двумя внутренними мембранными опорами, удерживаемыми вместе внешним корпусом экструдера и стопорной гайкой. Поместите установку в стойку экструдера, чтобы завершить настройку мини-экструзионного аппарата. Затем загрузите смесь липидной воды в герметичный шприц объемом один миллилитр.

Используйте зажимы для поворотного рычага, чтобы закрепить шприц на одном конце мини-экструдера. Вставьте второй шприц в другой конец мини-экструдера, убедившись, что он полностью нажат. Теперь пропустите через аппарат смесь липидной воды из исходного шприца в пустой.

Повторив экструзию 11 раз, переложите внедорожники в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Чтобы собрать протокол бесклеточной экспрессии, пипетка растворяет от одной до 3 плазмид ДНК, кодирующих растворимый SFGFP или варианты глутаматного рецептора SFGFP, мышиную РНКазу и раствор SUV, во флаконе. Добавьте сверхчистую деионизированную воду, чтобы довести объем реакции до 20 микролитров.

Перенесите бесклеточный раствор для экспрессии на 96-луночную коническую V-образную нижнюю пластину. Инкубируйте планшет в считывателе при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех-пяти часов. Настройте считыватель пластин с коэффициентом усиления 100, возбуждением 485 нанометров, излучением 528 нанометров, временем работы пять часов и интервальным измерением одного считывания каждые две минуты.

Измеряйте сигнал GFP каждые две минуты, чтобы отслеживать бесклеточную реакцию в режиме реального времени. Растворимый SFGFP имел самую высокую экспрессию среди всех трех белков.