Для начала приготовьте внешний буферный раствор GUV в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров. Смешаны спермидин, АТФ, ГТФ, CTP, УТФ, креатинфосфат, ацетат магния, глутамат калия, HEPES, гидроксид калия, фолиевая кислота. глюкоза и запас аминокислот.
Добавьте ультраочищенную деионизированную воду, чтобы довести итоговый объем раствора до одного миллилитра. Далее в вытяжной шкаф добавьте 17,3 микролитра стокового раствора POPC в стеклянный флакон объемом 15 миллилитров. Для этого пипеткой пипетируют 1,08 микролитра сополимера PEO-b-PBD.
Осторожно вдуйте слабую струю газообразного аргона в стеклянный флакон, вращая флакон, чтобы испарить хлороформ. Затем нанесите пипеткой в стеклянный флакон 1,2 миллилитра светлого минерального масла. Нагнетайте липиды и масло на максимальной скорости в течение 10-20 секунд.
Поместите стеклянный флакон в духовку при температуре около 50 градусов Цельсия на 20 минут, а затем закрутите еще на 10-20 секунд на максимальной скорости. Далее пипеткой наберите 270 микролитров наружного раствора GUV в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Для этого пипетку пипетку по 15 микролитров пяти моляров хлорида натрия и 4,5 моляра хлорида калия.
Аккуратно нанесите пипеткой 300 микролитров смеси липидов и масла поверх наружного раствора GUV. После инкубации соберите реакцию CFE путем пипетирования растворов 1-3, плазмиды ДНК, кодирующей растворимый sfGFP или варианты глутаматного рецептора sfGFP, мышиной РНКазы и одного моляра сахарозы в флакон. Добавьте сверхчистую деионизированную воду, чтобы довести объем реакции до 20 микролитров.
Добавьте 600 микролитров липидно-масляной смеси в микроцентрифужную пробирку, содержащую 20-микролитровую реакционную смесь. Энергично пипетируйте вверх и вниз в течение одной минуты, чтобы эмульгировать реакцию. Аккуратно нанесите внутреннюю эмульсию поверх слоя масла в тюбике.
Центрифугируйте в течение 10 минут при 2000 g при четырех градусах Цельсия. Затем тщательно выведите излишки масла и наружного раствора из микроцентрифужной пробирки. Аккуратно смешайте гранулу GUV с оставшимся раствором, чтобы снова суспендировать ее.
Перелейте раствор GUV на чистую 96-луночную пластину с плоским дном для инкубации. Переложите запечатанную пластину в считыватель планшетов для инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-шести часов. После инкубации поместите планшет на перевернутый конфокальный микроскоп.
Сфокусируйтесь на области интереса, содержащей GUV, затем сделайте снимки на длине волны возбуждения 488 нанометров. Сохраните изображения в формате TIFF. Откройте изображения в программном обеспечении для обработки изображений.
Нажмите на панель настроек Яркость/Контрастность, чтобы открыть ее. Затем отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы сделать флуоресцентные белки видимыми. Реакции безклеточной экспрессии глутаматных рецепторов дикого типа, инкапсулированные в GUV, продемонстрировали превосходную экспрессию и мембранную локализацию.
PRSP-глутаматный рецептор был склонен к агрегации и точечному образованию. Растворимый sfGFP экспрессировался в GUVS и оставался в просвете GUV.
