Для начала подключите 3D-принтер к компьютеру. Загрузите одноразовый шприц объемом один миллилитр с помощью иглы в зажимы, напечатанные на 3D-принтере. Используйте два торцевых болта M8, чтобы закрепить зажимы вокруг шприца.
Поверните ходовой винт, чтобы вручную поднять поршень, создав в шприце двухмиллилитровый воздушный зазор. Для приготовления культур холерного вибриона инокулируют клетки в три миллилитра отвара Лурии с 10 стерильными стеклянными шариками. Выращивайте клетки во встряхивающемся инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-шести часов.
Аналогично прививают кишечную палочку в три миллилитра жидкого отвара Лурия. После ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия инокулируют 200 микролитров культуры в свежий отвар Лурия на три часа. Перенесите культуру в центрифужную пробирку объемом 10 миллилитров.
Затем центрифугируйте его в течение пяти минут при температуре 644 г при комнатной температуре. Теперь удалите надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте гранулу в 10 микролитрах жидкого отвара Лурия. Далее загрузите в 3D-биопринтер пустой пластиковый шприц объемом три миллиметра.
Соедините поршень шприца с ходовым винтом. Втяните шприц вручную, чтобы переместить воздушный зазор, чтобы обеспечить лучшее движение поршня. Прикрепите тупую иглу подходящего размера к наконечнику шприца.
Вручную поверните винт, чтобы втянуть поршень шприца и загрузить бактериальную суспензию в шприц. Для приготовления гранулированной гидрогелевой смеси смешайте сухие гранулы сшитой акриловой кислоты с 400 миллилитрами 2%-ного бульона Леннокса Лурия-Бертани. Отрегулируйте pH до 7,4 с шагом 500 микролитров 10 молярного гидроксида натрия и проверьте pH на тест-полоске.
С помощью стерильного пластикового шприца объемом 50 миллилитров переложите гидрогелевую смесь в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте матрицу при 161 G в течение одной минуты при комнатной температуре. Далее с помощью шприца объемом 30 миллилитров перенести необходимый объем матрицы в емкость, где будет происходить печать.
Затем поместите контейнеры с образцами с гидрогелевой матрицей в держатели на рабочей платформе принтера. Запустите программное обеспечение для 3D-печати. Нажмите на файл, затем нажмите «Открыть файл», чтобы загрузить предварительно запрограммированный gcode в программное обеспечение.
Введите длину перемещения. Затем переместите плоскости X, Y, Z, чтобы центрировать печатающие головки в плоскости X/Y. Нажмите на значок «Домой», чтобы отрегулировать ось Z.
Медленно вращайте винт вручную, чтобы нажать на поршень шприца, пока на кончике иглы не появится небольшое количество бактериальной суспензии. Сотрите излишки суспензии стерильной одноразовой салфеткой. Теперь опустите печатающую головку на фиксированное расстояние в гидрогелевый носитель любого контейнера для образцов.
Нажмите на печать, чтобы начать печать. После завершения печати закройте контейнеры для образцов. Утилизируйте шприц и иглу надлежащим образом.
Протрите принтер 70%-ным этанолом. Для съемки с большим полем зрения используйте камеру с прикрепленным зум-объективом. Изображение ячеек сразу после печати при комнатной температуре.
Затем перенесите образцы в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию. Различия в размере пор матрикса, по-видимому, не влияли на немодальное клеточное распространение. Однако модальные клетки быстрее распространяются в матриксе с более крупными порами по сравнению с меньшими порами.
Колония холерных вибрионов в гидрогелевых матрицах с более крупными порами распространяется гладкими диффузными шлейфами. Диффузные шлейфы отсутствовали в немодальных ячейках. Колония в гидрогелевых матрицах с меньшими порами распространяется только через шероховатые, фрактальноподобные шлейфы как для модальных, так и для немодальных клеток.
Было замечено, что обе клетки распространяются с одинаковой скоростью в течение первых 150 часов. Однако в течение более длительных периодов времени некоторые образцы демонстрировали более высокие темпы распространения. После эксперимента в гидрогеле наблюдалось снижение предела текучести, модулей накопления и модулей потерь.
