Для начала центрифуга трипсинизировала нормальные дермальные фибробласты человека. Извлеките надосадочную жидкость из центрифужной пробирки. Добавьте в гранулу предварительно подогретую добавку DMEM с низким содержанием глюкозы и хорошо перемешайте, чтобы снова суспендировать ее.
Поместите нормальные дермальные фибробласты человека в 10-сантиметровую чашку для клеточной культуры. Аккуратно покачайте блюдо крест-накрест. После 14 дней 2D-стимуляции, когда клетки сливаются, аспирируйте среду и используйте скребок для клеток, чтобы аккуратно и быстро отделить сформированный клеточный лист от чашки.
Одновременно сверните клеточный лист в 3D-стержнеобразный органоид. Перенесите нормальные органоиды дермальных фибробластов человека в неадгезивную чашку Петри шириной 10 сантиметров. Измерьте удлинение линейкой.
Затем удерживайте одну сторону органоида пинцетом и осторожно растягивайте органоид, пока он не удлинится в осевом направлении примерно на 10%.С помощью пинцета вручную вдавите металлические штифты через оба края органоида в пластиковую тарелку, чтобы зафиксировать его. Наконец, для 3D-созревания добавьте 10 миллилитров предварительно подогретой добавки DMEM с высоким содержанием глюкозы перед инкубацией. Общая морфология 3D-органоидов на нулевой и 14-й день стадии 3D-созревания показала блестящий, белый вид.
Со временем органоиды сжимались и казались более плотными. Морфологию органоидов оценивали с помощью H E окрашивания. В первый день органоиды показали разрозненные слои, в основном состоящие из клеток, окруженных небольшим количеством матрицы.
Клетки внутри слоев имели ядра круглой формы и различных размеров. На 14-е сутки наблюдалось заметное усиление сигнала эозина, что свидетельствовало о матричном осаждении и сплавленных слоях. Более того, органоиды показали наличие областей, содержащих выровненные клетки.
Большинство ядер имели одинаковые размеры, а иногда и удлиненные.
