mOrange-Nano Рекрутинг для функционализированных поддерживаемых липидных бислоев (SLB) disiLID для генерации белковых паттернов

Для начала возьмите микрослайд на 18 лунок со стеклянным дном камеры, добавьте в каждую лунку камеры по 150 микролитров гидроксида натрия и выдержите в течение одного часа при комнатной температуре. Затем удалить раствор гидроксида натрия и промыть лунки три-пять раз деионизированной водой, после чего следует три промывки буфером, содержащим 10 миллимоляров хлорида кальция. Далее добавьте 15 микролитров свежеприготовленных внедорожников в лунки, содержащие 150 микролитров буфера с 10 миллимолярами хлорида кальция.

После 30 минут инкубации при комнатной температуре промыть SLB не менее семи раз буфером, не содержащим хлорида кальция. Для функционализации биотинилированных SLB стрептавидином добавляют раствор стрептавидина. Затем промойте SLB не менее пяти раз буфером, чтобы удалить избыток стрептавидина.

Далее добавьте в лунку b-disiLID до конечной концентрации в один микромоляр. После 30 минут инкубации при комнатной температуре промойте излишки белка буфером не менее пяти раз. Затем добавьте mOrange-Nano до конечной концентрации 200 наномоляров.

Накройте образец алюминиевой фольгой и держите в темноте. После этого поместите микропредметное стекло под флуоресцентный микроскоп. Установите лазер 552 нанометра для визуализации mOrange-Nano.

Флуоресцентная микроскопия выявила mOrange-Nano, структурированный на основе SLB, функционализированных с b-disiLID. После фотоактивации происходит быстрое усиление флуоресцентного сигнала в оранжевом канале в пределах исследуемой области. Флуоресценция mOrange-Nano увеличивается после насыщения каждой фотоактивации в течение 120 секунд, а затем снижается до фонового уровня в течение следующих 120 секунд.