Встраивание глазной ткани и криосекция в состав с оптимальной температурой резки для флуоресцентной визуализации

После того, как криозащита кроличьего глаза будет завершена, переложите его из 30% раствора сахарозы в 100-миллиметровую чашку для вскрытия. Под препарирующим микроскопом осторожно переверните глаз, чтобы удалить излишки раствора сахарозы с внутренней части глаза. С помощью салфетки аккуратно сотрите излишки раствора сахарозы с наружной части глаза, заполните одноразовую закладную форму оптимальной температурой резки или ОКТ-составом на глубину от 0,5 до одного сантиметра.

Поместите глаз в форму для встраивания лицевой стороной вверх и медленно заполните внутреннюю часть глаза составом OCT, избегая образования пузырьков. Как только глаз выйдет из ОКТ-соединения и не будет касаться внутренних поверхностей формы, оберните форму для встраивания в парафин и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день поместите форму для закладки в чашку для препарирования.

Если возможно, аккуратно удалите ОКТ-соединение с внутренней стороны глаза с помощью салфетки. Перенесите глаз в новую форму для заделки, заполненную свежим составом OCT. Затем заполните форму, как это было сделано ранее, чтобы убедиться, что на окончательной закладочной среде нет мусора или дефектов.

Пометьте форму в целях ориентации. Расположите глаз вверх в криоформе, чтобы ОКТ-соединение выстилало внутреннюю сетчатку. Используйте диск зрительного нерва в качестве ориентира для определения верхней части глаза Поместите маркированную форму для встраивания на сухой лед, следя за тем, чтобы глаз не касался внутренних поверхностей формы и не подвергался воздействию воздуха.

Установите блок на криостат так, чтобы верхняя часть глаза была обращена вверх, а нижняя – вниз. При этом оставшаяся роговица и радужная оболочка обращены вправо или влево. Расположите свежее лезвие параллельно вертикальной оси глаза, чтобы разрезать его.

После нарезки срезов и сушки в течение ночи поместите горку в морозильную камеру при температуре 80 градусов Цельсия. Флуоресцентные изображения всей сетчатки криосекции кроличьего глаза показали однородный пигментный слой пигментного эпителия сетчатки без значительного отслоения от вышележащего слоя фоторецептора. Светлопольное изображение среза сетчатки дополнительно демонстрирует неповрежденную морфологию сетчатки всех слоев.