Клонирование гена вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней в вектор pVAX1

Начните с линеаризации вектора. Приготовьте реакционную смесь, содержащую специфические ферменты рестрикции, при комнатной температуре. Используйте набор для экстракции геля, чтобы очистить линеаризованные векторы, затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут.

Затем соберите бесшовное клонирование экзона R и реакцию сборки для субклонирования гена PRRSV. Отрегулируйте общий объем реакции до 10 микролитров стерилизованной деионизированной водой. Затем тщательно перемешайте.

Выдержите смесь в термоамплификаторе от 15 до 60 минут при температуре 50 градусов Цельсия. После этого храните образцы на льду. После трансформации вектора в компетентные клетки выберите восемь колоний в 20 микролитров среды LB, содержащей канамицин.

Настройте колонийную ПЦР-реакцию для анализа трансформантов. Полноразмерный вектор сверхэкспрессии РРСС был получен путем введения первого фрагмента РРСС в вектор pVAX1, в результате чего образовался pVAX1-F1. Последовательные раунды рекомбинации с использованием специфических ферментов рестрикции привели к включению фрагментов со второго по пятый, визуализируемому увеличением размера плазмиды.