Крупномасштабная трансформация плазмид UAS-кДНК/ORF из модульной сборки на основе CRISPR в E. coli

Обратите внимание на то, что все переводы сгенерированы ИИ. Нажмите здесь для версии на английском языке.

73 Views

•

01:46 min

•

May 17th, 2024

DOI :

10.3791/201692-v

May 17th, 2024

•

Si Xu*¹^,², Mengyu Chen*¹^,², Guang Chen¹^,³, Si Luo⁴, Wen Xue¹^,², Xuelian Liu¹^,², Jiwu Wang¹^,²^,³, Ping Wei⁴

¹Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ²Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ³Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ⁴Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* Эти авторы внесли равный вклад

Транскрипт

Чтобы преобразовать продукты плазмид кДНК/ORF БАС, полученные из модульной сборки на основе CRISPR, в кишечную палочку, предварительно охладите 10 микролитровых наконечников при четырех градусах Цельсия. Также предварительно охладите 1,5 миллилитровые трубки в алюминиевом охлаждающем блоке на льду. После размораживания компетентных клеток E.coli на льду в течение пяти минут добавьте аликвоту 10 микролитров клеток в каждую предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую пробирку.

Затем добавьте по одному микролитру продуктов плазмиды кДНК/ORF UAS в каждую пробирку, содержащую 10 микролитров компетентных клеток. Аккуратно перемешайте трубку и положите ее на лед на 30 минут. Инкубируйте трубки при температуре 42 градуса Цельсия на водяной бане в течение одной минуты.

Затем сразу охладите на льду в течение двух минут. Добавьте 100 микролитров среды SOC, предварительно подогретой до 37 градусов Цельсия, в каждую пробирку комнатной температуры и инкубируйте пробирки в встряхивающем инкубаторе при 250 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем нагрейте планшеты LB, содержащие антибиотик, соответствующий гену устойчивости к антибиотикам модуля UAS до 37 градусов Цельсия.

Разложите клетки по теплым пластинам и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

Смотреть дополнительные видео

Из серии

Построение высокопроизводительной библиотеки плазмид UAS-кДНК/ORF с использованием CRISPRmass