Визуализация активности на уровне отдельных клеток у неонатальных мышей с помощью двухфотонной микроскопии

Для начала прикрепите двухосевой угломер с титановой пластиной к пластине предметного стола для позиционирования XY под микроскопом. Активируйте программное обеспечение для сканирования, установите двунаправленное положение пикселей 512 на 512 с помощью объектива с 20-кратным увеличением. После проведения операции на черепно-оконном аппарате поместите щенка, экспрессирующего GCaMP, на одну сторону полушария на грелку.

С помощью саморезов закрепите крепление головки титанового бруска к титановой пластине. Затем отрегулируйте угол наклона окна по горизонтали с помощью угломера. Осветите поверхность мозга подсветкой и выберите область визуализации с помощью позиционирования XY с 5-кратным объективом.

Под 20-кратной линзой для погружения в воду нанесите глазные капли на окно черепа. После отключения подсветки сканируйте поверхность мозга в однофотонном режиме. Увеличьте интенсивность лазера, чтобы визуализировать зеленую автофлуоресценцию от стекла и поверхности мозга.

Накройте микроскоп крышкой, чтобы предотвратить внешние световые помехи. Запустите программное обеспечение сканирования в двухфотонный режим для получения изображений. Затем откалибруйте мощность лазера и коэффициент усиления детектора для оптимальной визуализации сигналов GCaMP.

Определите глубину в области визуализации, заполненной множеством нейронов, экспрессирующих GCaMP, и запустите интервальную съемку для захвата сигналов GCaMP. Двухфотонная микроскопия выявила активность нейронов четвертого слоя в коре головного мозга щенка шестого дня после рождения с зеленой флуоресценцией. Зеленый GCaMP был более заметным, что привело к утечке сигнала в красный канал и идентификации 14 областей интереса.