Для начала засейте HEK293T клетки в 10-слойную клеточную фабрику, содержащую среду DMEM с высоким содержанием глюкозы и 10% FBS. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия при добавлении 5% углекислого газа на ночь. Далее изготовьте 350 миллилитров Opti-MEM в стерильную 500-миллилитровую бутылку.
Добавьте ДНК плазмы для трансфекции в бутылку и встряхните, чтобы хорошо перемешать. Теперь добавьте в бутылку 15 миллилитров раствора PEI. Энергично встряхивайте смесь в течение 30 секунд, чтобы обеспечить равномерное перемешивание.
После инкубации смеси при комнатной температуре в течение 15 минут переложите ее в литровую бутыль. Затем добавьте 700 миллилитров DMEM с низким содержанием глюкозы. Извлеките 10-слойную фабрику ячеек из инкубатора и опустошите среду в контейнер для отходов.
Осторожно нанесите смесь для трансфикации ДНК в Cell Factory. Затем поместите Cell Factory обратно в инкубатор на срок от 72 до 96 часов. Через три-четыре дня отфильтруйте осветленную надосадочную жидкость через фильтрующую установку толщиной 0,45 микрометра.
Добавьте 500 миллилитров DPBS в Cell Factory для промывки. Центрифугируйте его при 4000 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью вакуумной системы и аспирационной пипетки удалите надосадочную жидкость.
Добавьте в гранулу 20 миллилитров буфера для лизиса AAV и перемешайте, чтобы повторно суспендировать гранулу в буфере. Хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия до очистки. Теперь добавьте 40% раствор ПЭГ натрия хлорида в раствор AAV, доведя конечную концентрацию до 8% ПЭГ.
Поместите смесь на низкоскоростной орбитальный вращатель на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Центрифугируйте раствор при 4 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия для выпадения вируса в осадок. Выведите надосадочную жидкость из пипетки.
Затем было от пяти до 10 миллилитров буфера ресуспензии AAV HEPES к грануле. Перелейте суспензию в 50-миллилитровую коническую трубку, чтобы продолжить последующую очистку. Затем закрепите иглу 16-го калибра, установленную на 10-миллилитровом шприце, и наложите подготовленные градиенты йодиксанола в полипропиленовую ультрацентрифужную пробирку с круглым верхом.
С помощью иглы 22-го калибра осторожно добавьте до 17 миллилитров раствора AAV поверх градиента. Долейте до трубки диализный буфер AAV. Запечатайте трубки электрогерметиком.
Центрифугируйте пробирки при 350 000 g в течение двух часов в титановом роторе при температуре 4 градуса Цельсия. Затем переложите их в штатив для ультрацентрифужных пробирок. Теперь используйте новую иглу 18-го калибра для переноса вируса AAV в диализную кассету.
Удалите воздух из кассеты после введения в нее вируса. Поместите полосу мешалки в стакан с диализным буфером AAV и переложите его на пластину для перемешивания. Затем поместите диализную кассету в буфер с помощью поплавкового буя.
С помощью 10-миллилитрового шприца перенесите вирус из кассеты в центробежный фильтрующий блок. Центрифугируйте при 4000 г в течение 15-30 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите концентрированный AAV из фильтрующего блока.
Затем промойте фильтр 300 микролитрами диализного буфера AAV. Наконец, перелейте раствор для полоскания в концентрированный AAV. Было обнаружено, что выделенный вирус AVV имеет чистоту более 90%, что делает его пригодным для использования in vivo.
