Живое/мертвое окрашивание клеток скелетных мышц, выделенных из мышей, поврежденных нотоксином, с фиксацией цисплатином и параформальдегидом

Для начала суспензируйте скелетные мышечные клетки, выделенные у мышей, поврежденных Notexin, помеченных йододезоксиуридином в одном миллилитре холодного сывороточного свободного DMEM, и подсчитайте их с помощью гемоцитометра или клеточного счетчика. Под вытяжной шкаф добавьте бульон цисплатина, чтобы достичь конечной концентрации 25 микромоляров. Сделайте трубку вихревой в течение 10 секунд и инкубируйте при комнатной температуре в течение одной минуты.

Погасите реакцию ледяным DMEM, содержащим 10% FBS, и поместите его на лед. После гранулирования и ресуспензии клеток отфильтруйте суспензию через сетчатое фильтр с ячейками 35 микрометров. Под вытяжной шкаф добавьте отфильтрованный исходный раствор параформальдегида, чтобы зафиксировать клеточную суспензию и вихрь на 30 секунд.

Промойте его два раза двумя миллилитрами красителя клеток или CSM методом центрифугирования. После окончательной промывки отасуньте надосадочную жидкость примерно до 60 микролитров и тщательно повторно суспендируйте гранулу. Добавьте 40 микролитров в 2,5 раза больше смеси для окрашивания поверхностных антител, приготовленной в CSM, и инкубируйте в течение одного часа, делая их вортексированием каждые 20 минут.

После двукратной промывки образца с помощью CSM аспирируйте надосадочную жидкость и взбейте гранулу. Чтобы проникнуть в клетки, под вытяжной шкаф добавьте по каплям 0,5 миллилитра ледяного метанола во время вортексирования. Дважды промойте клетки одним миллилитром CSM методом центрифугирования.

После последней промывки аспирируйте надосадочную жидкость примерно до 60 микролитров и тщательно суспендируйте гранулу. Инкубируйте клетки с 40 микролитрами смеси для окрашивания внутриклеточными антителами в течение одного часа, при этом перебирая образцы каждые 20 минут. После двукратной промывки клеток одним миллилитром ЦСМ повторно суспендировать образцы в 0,5 миллилитрах интеркалятора раствора иридия и вортекса.