Для начала возьмите клетки скелетных мышц, окрашенные цисплатином, металлическими конъюгированными антителами и раствором интеркалятора-иридия, и гранулируйте клетки центрифугированием. Как только надосадочная жидкость будет удалена, добавьте один миллилитр CSM в вихревые клетки. Гранулируйте ячейки центрифугированием и промойте в одном миллилитре буфера CAS.
После центрифугирования отаскайте надосадочную жидкость примерно до 200 микролитров. Добавьте один миллилитр буфера CAS к вихревым образцам и добавьте пять микролитров для подсчета клеток. После центрифугирования клеток и аспирации надосадочной жидкости до 50 микролитров ресуспендируйте клетки в буфере CAS до конечной концентрации 1 миллион клеток на миллилитр и добавьте калибровочные шарики для достижения конечной концентрации 0,1x.
Загрузите образец в массовый цитометр для сбора данных, используя скорость потока от 400 до 500 клеток в секунду, и нормализуйте данные после сбора. При необходимости объедините отдельные файлы стандарта проточной цитометрии или FCS для каждого образца в один файл. Идентификация отдельных клеток путем стробирования по положительным событиям интеркалятора иридия.
Выберите события, которые являются отрицательными для цисплатина, чтобы затворить живые клетки. Определите интересующую популяцию и количественно определите относительную долю стволовых клеток и клеток-предшественников. Чтобы выполнить многомерный анализ, экспортируйте интересующую совокупность и используйте алгоритмы кластеризации.
Для анализа X-shift загрузите программный пакет Vortex и 64-разрядную версию Java. Загрузите экспортированные популяции ячеек в локальную базу данных и определите параметры кластеризации. Чтобы визуализировать пространственные отношения между популяциями клеток в кластерах X-shift, выполните компоновку, направленную на силу.
Анализ CyTOF идентифицировал последовательность четырех популяций, стволовых клеток и популяций предшественников от одной до трех. Популяции предшественников P1 и P2 соответствуют все более зрелым клеткам-предшественникам. P3 был ранее идентифицирован, но не охарактеризован из-за его низкой численности.
Динамику стволовых и прогениторных клеток после травмы анализировали с помощью CD9 по CD104 с помощью аксиальных точечных графиков. Заметное увеличение популяции стволовых клеток наблюдалось на третий день, что свидетельствует о росте. Это подтверждалось повышенным включением йододезоксиуридина, указывающим на пролиферацию клеток, и повышенной экспрессией MyoD, о чем свидетельствует наложение цвета.
Активированные стволовые клетки, отмеченные высокими уровнями CD98, CD44, MyoD и йододезоксиуридина, были идентифицированы, что подчеркивает их высокую пролиферацию и активированное состояние на третий день после травмы.
