Для начала распылите на кожу мыши 70% этанола. Затем с помощью стерильных ножниц для рассечения вскройте кожу и обнажите мышцу ноги. Разрежьте мышцу вдоль ноги, чтобы четко видеть кость, и аккуратно удалите кость, не повредив ее.
Немедленно поместите кость в пробирку, содержащую 4% паральдегида, и положите пробирку на лед. После сбора всех образцов костей поместите пробирки при температуре четыре градуса Цельсия в холодную комнату на орбитальном шейкере минимум на 24 часа. После фиксации извлеките костную ткань из орбитального шейкера и промойте 1X PBS дважды по три минуты каждый.
Затем с помощью стерильных ножниц для препарирования удалите все оставшиеся мышцы, прикрепленные к кости. Снова промойте кость 1X PBS в течение трех минут. Поместите кость в новый контейнер, содержащий 20% ДДТА при pH 8, и инкубируйте в орбитальном шейкере при 140 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.
Затем замените раствор ЭДТА свежим 20% ДДТА и повторите перемешивание еще 30 минут. После окончательной обработки ЭДТА добавьте свежую ЭДТА и инкубируйте контейнер при температуре четыре градуса Цельсия на орбитальном вибростенде в течение ночи. Затем достаньте образцы из контейнера ЭДТА и промойте их два раза с помощью 1X PBS, чтобы удалить остатки ЭДТА.
Запустите процесс обезвоживания, поместив кость в 70% этанол и инкубируя ее в течение 15 минут при 140 оборотах в минуту. Затем выбросьте 70% раствор этанола и добавьте 90% раствор этанола. Инкубируйте в течение 15 минут при 140 об/мин.
Затем запустите процесс очищения, поместив обезвоженную костную ткань в новый контейнер с ксилолом. Инкубировать в течение 20 минут при 140 об/мин. Замените использованный ксилол свежим и выдержите еще 20 минут.
Затем поместите очищенный образец кости в закладную кассету и начните инфильтрацию воском. Выдерживать 30 минут при температуре 60 градусов Цельсия. Выбросьте использованный воск, добавьте новый воск и выдерживайте еще 30 минут.
Затем замените воск и выдерживайте еще 45 минут. Аккуратно расположите кость в форме в нужной ориентации. Дайте воску застыть на холодной поверхности.
Храните блок при температуре четыре градуса Цельсия до раздела. Далее подготавливаем оборудование к секционированию. Опрыскайте все рабочие поверхности и инструменты обеззараживающими растворами для удаления РНКазы.
Также установите водяную баню с двойной дистилляцией воды при температуре 42 градуса Цельсия. Очистите лезвие микротома 70%-ным этанолом, чтобы удалить масло, затем обеззаритите его, чтобы удалить РНКазы. Закрепите лезвие на микротоме и убедитесь, что угол зазора установлен на 10 градусов.
Распылите на пинцет, щетки и щупы обеззараживающие растворы и храните их в одном ведре для льда. Приготовьте ледяную ванну, добавив двойную дистиллированную воду в другое ведро со льдом. Начните процесс секционирования, поместив блок FFPE на микротом.
Установите микротом на обрезку или установите толщину прокрутки 14 микрометров. Начните обрезку образца и продолжайте до тех пор, пока ткань не станет видимой. Увлажните блок FFPE, поместив его на ледяную баню.
Закрепите гидратированный образец в зажиме для микротома, совместите его с лезвием и установите толщину спирали на пять микрометров. Начните разрезать ткань. Соберите разрезанную ткань с помощью холодного пинцета и щеток, и поместите ее на водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия.
Поместите салфетку на предметное стекло и выдерживайте при температуре 42 градуса Цельсия в течение трех часов. Просушите горку в течение ночи в духовке при комнатной температуре. Храните подготовленную горку в коробке для слайдов при комнатной температуре.
С помощью этого метода из зеркальных бедренных костей получали деминерализованные образцы кости FFPE. Временной ход декальцинации был оптимизирован путем сравнения некальцинированных бедренных костей с декальцинированными в течение трех и 24 часов. Окрашивание H и E показало, что более короткое время декальцификации привело к переломам и повреждениям в срезах, в то время как 24-часовой процесс привел к превосходному гистологическому качеству.
Оценка качества РНК с использованием значения распределения фрагментов РНК DV200 показала, что декальцинированные образцы поддерживали баллы DV200 выше 50%, что подходит для таких анализов, как SCRNAC или пространственная транскриптомика. Тем не менее, увеличение времени инкубации привело к снижению целостности РНК и, следовательно, не рекомендуется.
