Для начала суспендируйте упакованную клеточную гранулу в объеме гипотонического буфера, равном семикратному объему клеточной гранулы. Перенесите клеточную суспензию в гомогенизатор Potter-Dounce и инкубируйте на льду в течение двух минут, позволяя клеткам набухнуть. Разорвите клеточные мембраны, выполнив от 8 до 10 движений в гомогенизаторе, соединенном с тефлоновым пестиком с приводом от двигателя, вращающимся со скоростью 600 об/мин.
Добавьте равный объем гипертонического буфера в клеточную суспензию для создания изотонической среды. Перелейте гомогенат в пробирку объемом от 10 до 15 миллилитров. Центрифугируйте при 1000G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и соберите надосадочную жидкость в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 миллилитров.
Чтобы собрать митохондриальную сырую фракцию, центрифугируйте в микрофуге при температуре 16 000 G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте обогащенную митохондриями гранулу с 0,5 миллилитрами буфера А. Объедините содержимое двух пробирок в одну и центрифугируйте, как было показано ранее. После последнего центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитрах буфера А. Количественно определите концентрацию митохондриального белка с помощью анализа Брэдфорда.
С помощью ножниц отрежьте от 20 до 30 миллиграммов ткани животного. Промойте салфетку три-четыре раза в гомогенизационном буфере с помощью ситечка, стараясь не потерять более мелкие кусочки. Переложите кусочки салфетки с буфером в гомогенизатор.
Для работы с печенью, селезенкой и почечными тканями выполните от четырех до шести движений вверх и вниз в LVM Potter с помощью тефлонового пестика с моторным приводом со скоростью 600 об/мин.
